WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

下载附件 (127.83 KB)

如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子
4 n9 Y' F" n' x/ u2 j; H5 @+ V5 J6 X# V$ N4 }
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子+ {+ q5 Z; _0 n( M9 {
! e) Q8 {4 s1 f
谢谢，自己做的

zhenhua

4 q* r/ a) U8 Y5 ?' G9 W+ y

- S8 I0 g, p, m9 c; n& T呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
  _+ E% w3 w& w  z! v5 _& c6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
. W6 W& C6 g! d如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。5 J7 N' d; M: l/ ~6 v
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。# O) h" W, |4 S: g2 v3 {  H3 o
这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
, @+ p, p. E4 B  O) X8 Z* a: d最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

回复 zhenhua 的帖子% w3 f4 b- D9 ^: i/ {5 k2 J9 s
8 t4 d: h) p' U  @; A1 `4 F! j! _
每个孔上20ul。
# T1 z+ s& C# D/ U煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

3 b$ T  t4 L! ~+ U( T

( S5 Y9 j- i& \我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

回复 hndxws 的帖子- B0 A  G2 e8 w8 O' D- y. h- K/ j% f
. b. \1 e1 ~0 v, b0 m
建议发新帖提问