WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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8 K- f. B0 J# O- p5 F, e  \
; |' w8 B( [! s# R) F直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

张也行

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7 O% M/ Y  c! q$ x: W3 c; N2 H* R, x8 T2 w: M0 a
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。

hndxws

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7 |; M' H! a; u3 S2 l# |1 i3 V5 @) Z# H5 i- t$ t, o5 E* z
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

shuixiao

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4 I5 N& M- J. M! t; p5 n+ ?- i0 c. y" \+ t# h$ S' x  Z6 h! o
BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。
) N1 }: |, H. v我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

7ubo

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* e8 `. T. E, L. q+ o" v9 H
2 H- m$ h: S2 ^朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

张也行

回复 hndxws 的帖子% T' V; ?9 ?1 k* h$ R

8 H, |- X9 }* I* B+ X一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

Learner

回复 7ubo 的帖子' f: C9 h: d1 w) ^: [; Y; u

- @  a! `' C: s% J' Z5 h  L蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

hndxws

回复 7ubo 的帖子& F. d. u8 q$ E8 h8 |4 J+ |! c

8 A7 H) Y( X' Q2 \带GFP的小鼠囊胚

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 3 W( ?5 ?; R- ^5 C! f
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？7 Q0 F0 _9 }3 \" J
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？! l( y: q5 p$ Z' c# T, p
...

7 o" Z) D8 D5 i. l# w" l
请问煮样20-30min，温度？

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？