WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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$ e! j1 S, x4 E3 y) X6 I3 k直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

张也行

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我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。

hndxws

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0 [; d4 ^/ f% Q0 ^5 x$ Y: U/ ?- }5 A2 I8 ^2 `/ p1 @! g
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

shuixiao

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$ n3 W* b4 P3 C3 P+ f  u+ A' z. ]# W, j8 S( a3 Q
BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。
( f, b6 T5 f3 a: x, \2 }+ e我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

7ubo

回复 hndxws 的帖子- @- _: \% a" X8 G8 h7 @
! W) u$ G. C$ y9 s5 }/ }3 \
朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

张也行

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5 g. J7 T/ D! O: N5 H: C$ o5 p0 j# O% [8 c; h+ Y2 ]/ u4 q8 v
一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

Learner

回复 7ubo 的帖子; a. ^  Z; p# p* t2 ]6 z7 b

0 s8 [$ |2 s+ i7 F( ?蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

hndxws

回复 7ubo 的帖子! e1 X' ~% y' _. M  t4 ], d

, ^3 g3 M3 \3 G4 `0 i9 a带GFP的小鼠囊胚

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 5 ^  r! f% ?$ O  |3 n" W
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
* q9 t: `& v6 Z. c% i  f8 {8 u6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？) v/ g6 V. t) ?9 h7 \
...

% X& k% [2 j6 J! \0 p8 V
请问煮样20-30min，温度？

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？