WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

zhenhua

回复 7ubo 的帖子2 G5 K% J( V* u9 L

! ]1 H& Z6 X( T6 ]$ w( v% B5 b20ul足够。# H" L6 v  @3 C. |: P; C1 D4 d
煮20-30分钟不会使蛋白降解。$ G, I1 @& \/ {- s2 E" _  ]
不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。
% J( k* r' S3 e4 V* m# \+ O% k% l可以用actin等高丰度蛋白试试效果。
/ h4 K! ?' f; V: l, s' m0 @- ?

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
1 S- E8 w4 j' ?呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
% B; z) |% Q0 j1 r! ^& e6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
$ }, e- u. [& w% b& T ...

- P! ]; u* u4 P; u请问煮样20-30min，温度？

hndxws

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) w) P% x. ~5 w3 g: J' J) q: Y9 ?$ R* Y' G- c& N
带GFP的小鼠囊胚

Learner

回复 7ubo 的帖子# t  ?. y' f! x* ]5 J' @: D
% m( z" F9 }& ]( R3 O" K* ^  j
蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

张也行

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1 s* q& E7 H- j2 [
, l; ^- f. J% z' Q8 l, h一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

7ubo

回复 hndxws 的帖子9 |5 F9 Z5 [, u- Q2 f+ \" b
* i3 C7 y& X) N- i1 O  x
朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

shuixiao

回复 7ubo 的帖子3 I5 @2 H5 Y* H. C; g

9 e' X% [% l& ]2 I9 U* m( x. x, QBCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。( q9 |+ d7 G8 E* w  A$ B6 l
我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

hndxws

回复 张也行 的帖子% g; Y0 B% p" d
; Y7 l( c# W# M  n3 {, n
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

张也行

回复 hndxws 的帖子/ U, y) q. j1 p
; H5 n  r* a1 ~8 m+ v1 Z4 X
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。