求助：大鼠骨髓间充质干细胞为什么总是老化了--多图

hemu00

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请各位前辈帮忙分析分析为什么我养的大鼠骨髓间充质干细胞总是老化了。
+ r+ ~4 F6 f) n4 K9 T2 v- k, q我用的培养基是DMEM/F12和DMEM-LG（gibco瓶装液体培养基）加10%胎牛血清（gibco澳洲产），未加双抗。0.25%胰酶+EDTA消化细胞。
3 r$ u+ S1 R" E5 n) G4 `动物选的是3-4周67g的SD大鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精中完全浸泡15min。无菌条件下取股骨、胫骨，完全培养基冲反复冲洗髓腔，双侧股骨和胫骨所得细胞平均接种入两个T25培养瓶（康宁），24h全量换液，72h全量换液前用HBSS洗两遍。
) i- c+ s6 `8 q! ], d- @2 I* `& S图一
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图二
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图三
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图四. Y# c& x$ E; ?4 S" t

) {) L! c! z) W. U' H: {8 P7 ~' O; ?图五& d+ z+ O5 {* x/ L  t# X- l
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图六) E1 C* _$ i: _1 n

2 O. q$ K0 [. T0 a1 a7 o图七# U# `. S6 m. A, o8 z+ C- N) d

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ljs

你这个问题我个人不是很有把握。给你个参考：1：培养基的问题。细胞生长不好，多半是培养基的问题，可能是质量问题，也可能是体积多或少。2.支原体污染。3.建议在胰酶消化过后，在计数时做台盼蓝染色，看看细胞活性。

金戈

从最后一张图片看，感觉不像典型的MSC细胞形态。可以肯定的是，你这个应该不是支原体的问题。

hemu00

回复 ljs 的帖子+ W% h, ]- @" j' @
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ljs前辈，我买的是Gibco的瓶装培养基，这个可以吗，会不会有假货的可能。体积的话是T25培养瓶加5-6ml。之前做过台盼蓝染色，活细胞是90%以上。还有怎么判断支原体污染呢？

hemu00

回复 金戈 的帖子
# l7 P/ x4 f) n$ t: A  N( K3 Q# N% z& t* c. `
斑竹，这些形态不典型的细胞是MSC吗？是MSC老化了还是其他杂细胞？

临床干细胞

你从哪里判断这是老化了呐？我想问你一个问题，你每次传代前都做计数了吗？我觉得这不一定是老化，而是plate中细胞比较少，胞间空间比较大，形态就是和细胞比较密的plate培养不一样，我的细胞也是这样，不过依然可以被诱导分化

hemu00

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不是每次都计数，之前计数的时候一般是按1-3*10^5传代接种的，后面就换成1:2传代了。细胞活性不是100%，90%左右。说细胞老化是因为细胞不是长梭形的了，太扁平了，立体感不强。和之前在网上看到的invitrogen公司的rMSC产品图（P4的细胞）相比差别太大了，见下图
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hemu00

都说细胞长起来之后要及时传代，各位前辈能不能提供一些细胞长到可以传代的照片呢？
4 n, j- F- t: J4 u- I# ~原代培养的时候细胞集落长到多密需要传代，有些集落长得很快，同时其他地方都没有细胞也需要传代了吗？

1301918986

因为rMSC的原代培养是克隆生长的，会形成细胞集落，当然也就会出现局部细胞比较密集的情况。我们实验室一般是多数克隆中心的细胞比较密集时就传代了，当然这时细胞并没有长到整个瓶底的80%。当然，这只是我的经验，仅供参考。

kgx1986

原代接种细胞的数量过少会导致细胞容易老化；胰酶消化太过对细胞造成损伤会导致细胞容易老化；你是否考虑过这些问题呢？