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【材料及准备】
* I" I3 Y/ }1 A p' e) J1.一般的盖玻片，或专用爬片；9 ]& G4 z/ b- Y% n+ z
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
+ j) y' |' w. j8 r' ~7 i+ n3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
+ R0 C/ q* {! ]7 P7 O" c4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
3 g1 l- H! N" e9 a: G5 ?0 ?5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。3 @$ h0 w/ H, S+ h' V+ N; e
6.常用的固定液) a) u- E: A4 W' H O. N5 l1 l
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。+ `7 G! n9 m, e5 S9 ^
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 ! Q) w7 V1 r! z; p( J
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
d1 R$ w8 E; j- f( s, q6 n室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
% x, T# V/ f& B$ l& _9 \优点：穿透性强、抗原性保存较好。
! Y5 N$ m9 l0 `. V) _0 @缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度* k# v9 S2 w# i( d* w- u
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
$ i$ W1 c7 d" B" ^; S- J优点：形态结构保存好，且穿透性强，$ [2 C7 \% e9 }
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
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- C. ~& m0 A2 U# [+ E6 i【细胞爬片步骤】) K- p3 h/ H" E
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
5 D$ l8 k, w) Q8 E$ V2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。5 h, b% }; k4 M, w2 d/ m' [7 Y# f+ \
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
- y: \# r; \; L. I4 L: F7 [' n4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
) q9 }. i1 c1 h4 e5 N# s9 E5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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【细胞爬片的固定】8 H; @. y. x8 q
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。& m: S& B: c2 O0 D
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。% Y5 h* J& M7 C
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发表于 2011-6-23 22:26
