教你如何做细胞爬片

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【材料及准备】
! T% |9 |) U' n: H- ]" ]1 Q1.一般的盖玻片，或专用爬片；
2 h/ r9 E9 H, A" M2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；, B) q$ w1 R2 {6 T! e2 @+ ?$ X
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。) |3 o2 W" \# W% i  F
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
' J' Q1 ~0 K& H9 ^* V1 O5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
2 q7 S+ g5 G! s# j6.常用的固定液
7 o( Q1 M9 C4 T0 l: v6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
, {& Y1 U4 j% K1 V! Q4 ^! w. y将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。  m4 v8 n- g. D8 _" U8 f+ M
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 # m5 ]; d2 a3 B4 b( W) f& a8 C
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等- U" h: C  f. }3 Q. X( Y
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存1 C  k2 `# M5 N( r
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
- k& @& }9 ]  C优点：穿透性强、抗原性保存较好。5 _5 \8 d; U& H2 T1 g
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
9 i9 y5 I, P; [* y1 \/ r室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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1 y! q6 Y- b" @: k; k5 \% y. D6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
( E! K- K$ ]! f6 M+ M) J# G优点：形态结构保存好，且穿透性强，
9 v' C) O* |8 r* d* X4 Q缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。8 R  {: A$ x* t! z% q( S
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【细胞爬片步骤】2 d+ [- O  s) R- ~1 y# u& O
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。# P5 }9 X# V6 x( P
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。4 e3 s" J+ V" a3 u1 a3 G
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可6 S2 N/ q5 x5 z' B
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
) `& J# ~+ i# q9 u5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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6 Z3 {! h4 d4 i: V/ P* y6 U【细胞爬片的固定】( N4 k6 v4 W1 T
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。3 E( R) s3 i. }% T: G2 O% f# P
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。' R# h: d2 ^; t# }7 {! A

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