教你如何做细胞爬片

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【材料及准备】
& d- r( r  _& G/ q; ^1.一般的盖玻片，或专用爬片；
* M3 Y) w0 p% \0 E2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
% Q& Q( J4 Y* t( [( x/ z1 O3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。  H2 [/ V) a1 U9 d' J
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
; W$ r- f  w: ]8 u2 Y# e5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。, P( A* x1 c+ Q( p/ A
6.常用的固定液, `: k- u# C" ?
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
0 d" m6 p# l4 d, N, @将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
) U! `1 A; G/ T! g, d# @2 s主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
( x  S8 i$ i  L, \# M  H# r室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
+ ]+ j1 z: K' N* @) {1 o* U% w优点：穿透性强、抗原性保存较好。2 x+ L) b! M0 Q7 Z& W
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3 b. B+ E1 ^! D7 F
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
1 l  u4 c0 I$ v2 A$ C0 Q7 Y/ ?优点：形态结构保存好，且穿透性强，+ J9 }3 f$ l  `7 u! V5 s! ?
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
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& D* C3 Y$ B( P7 ?" U【细胞爬片步骤】
' `; b$ i  r1 D0 }2 G1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。  ~! n- s$ |' h; O! k
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。; k! U% g# l9 Q# \- k
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可3 Y3 w$ h, [" c$ d; s$ N; h
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。0 C8 @$ V( m- r: x6 F$ p
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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【细胞爬片的固定】9 M' V/ C8 J$ i$ ]/ G* W( r
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
: t4 \& C1 Y' r另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。+ Q. x# q# V3 j* w
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breakutopia

之前做爬片每次都要费好大劲把浮起来的爬片一个个按回去，原来还有这种操作

fm001982

写得很好，学习了。
  w) K! s4 l, D. o' F虽然最近才做爬片，但取片的方法值得借鉴。

OBGYNob

完全学习了

langziforever

嗯，学习啦，谢谢楼主！

viv2005

正好要做，学习了。不知道为什么要多聚赖氨酸处理，有人说说么，多大浓度，怎么处理

snickle

学习啦，谢谢！