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【材料及准备】) m/ I4 S9 [; `+ n% C
1.一般的盖玻片，或专用爬片；
) `0 u0 O2 H4 m' d) g& _$ B. o$ V2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
1 V0 O- A, T& N! V3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
" n. d; u. C; x9 k4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。. ^( l+ R# I! b' k( `) I( o
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。6 l5 H: T2 |/ u! f9 F: c, b
6.常用的固定液) ~$ o+ e1 L: l1 L, A5 n) o
6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
8 j& n, T- g! o+ v6 H将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。
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6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 ! f6 x' \+ }) ^2 ^, h2 v; e
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等4 P1 z: p% _4 o& v0 O i5 x( t5 |2 y
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存" M" k4 s) q2 O& S+ p' @8 E: T8 ~
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6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
% O* w H* Z* e+ }0 X. X/ ]优点：穿透性强、抗原性保存较好。, k# _+ e2 \3 h9 j# l# {3 P! f
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度; d: t( w+ Q' Y% M1 O
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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6.4 甲醛(福尔马林)应用最广 0 f; D1 l0 a# l
优点：形态结构保存好，且穿透性强，7 k- w5 C) z1 S7 o |6 _0 p) T
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
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, { _+ _% p8 b: R3 `, a【细胞爬片步骤】- K) R1 A: P9 E: j- { y# ^" A
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。+ C V2 F+ A6 v V
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
$ q' `7 @& E; ^3 {3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
! G2 z* \" o( m3 y9 j+ n& G. \& S4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。/ T7 Z9 @6 n7 g" K- o t
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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7 {0 b5 s. j1 l6 R( r! H【细胞爬片的固定】
( L+ t) }) i Z% X6 {细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。$ z' H# x. j5 C5 }
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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发表于 2011-6-23 22:26
