求助，逆转录病毒感染后MEF变圆，细胞漂~

sunshy2772

     我用Pmx逆转录病毒感染MEF细胞后，12小时后发现细胞基本都贴壁的很好，基本上没漂的细胞。但是，在换液后观察细胞变圆，有些细胞已经飘起来了。开始我以为是直接换干细胞培养液的问题，可是，今天我首先用MEF培养液换液，可是细胞也出现问题了~究竟是什么原因呢:'(+ K1 V' u# m! q" G( v3 s/ f
     我用的病毒液是新鲜的，没有浓缩，4度下保存的，我想是不是因为病毒液用的多了呢？我用的是48小时收集的病毒液，每孔2mL感染的。盼望各位给予解答。我都快愁死了~
* X% v7 r! C. v/ g) d5 a7 \     还有一个现象，就是细胞不贴壁。这是我做试验以来碰到的最大的问题，细胞养的好端端的，只换了一次液，就飘起来了；要不就是细胞状态不好，长的速度慢；要不就是，细胞一直长不起来，长着长着就漂了，一直找不到原因。养个细胞容易么:'(:'(

wangyimei

可能有这几个原因：) r' f" C% R& ~4 F; N6 ^
1病毒感染细胞，会对细胞造成一定的影响，多少都会影响其生长状态，有可能是病毒滴度较高，你可以将病毒稀释一下在使用，或者是缩短一下病毒的感染时间) _. [) M0 ~0 V+ @  @  n' s
2你换液时液体的温度，液体是否提前37度预热，如果凉的液体刺激病毒感染后的细胞，细胞就会变圆漂起0 s1 X) O* \, R% D6 r
3如果飘起的细胞太多，你可以收集一下该细胞培养上清离心，再用预热好的培养液重悬再培养看看，也许还有好的细胞能生长起来

cicadacjk

逆转录一般不会出现细胞大量死亡的情况，建议考虑其他培养过程的问题: l% O+ m- m* O7 t$ |; r
另外，你可以只加1/10的c-Myc先看看，c-Myc太多细胞也是会凋亡的

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子7 D2 S+ u# f) Y: R
, B6 |7 j! {1 j4 H/ C4 K8 I: F
这种情况我们一般是用realtimePCR来titer的, 原理和流式差不多) t$ J2 ]# d0 k; {
就是作一系列梯度transduction, 然后取小于25%细胞感染的孔来计算titer（因为这时大部分转染的细胞都是单病毒）。
1 v( I- }* {  B% a( S0 U7 {* ~( u% H# k+ ]
我们是做基因治疗的，所以所有病毒都要求测实际感染的滴度' c/ G5 n3 y* S9 q6 r/ D
其实我觉得如果就是转一下细胞用没必要这么严格，直接用RT-PCR定量病毒总量就可以
0 S  b7 d9 O; Z0 F有一片文献：http://www.nature.com/gt/journal/v6/n7/full/3300948a.html
3 y9 ^+ B% \) j. i; }! a

sunshy2772

回复 大刀无敌 的帖子7 U) v3 S: X6 h' N. ?

2 |4 b  L, z, R1 K; e: P% E师兄是版主啊，呵呵:)

大刀无敌

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9 I% c- v  i5 ?5 {9 T$ r% g
! Q4 G) z/ @* ?你可以用相同的条件生产GFP病毒做对照，用同样的病毒量感染细胞，然后计数发绿色荧光的细胞数算出GFP病毒的滴度，进而估计出你实际病毒的滴度。

sunshy2772

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. V5 h) Y5 @$ O7 E) O, E1 ?8 d; Y/ r: K  I' `7 _
谢谢你，我的是一个载体，如果和GFP两个载体是分开的话能用什么方法测定呢？5 R" t% B4 s0 p& ?2 n) J. ?

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子9 i6 w" q; e8 O, z7 J" I9 k

# v5 O$ T0 o  |5 v% Y9 }1 }# T* N/ {" Q用双向载体最方便,一边表达目的基因,一边是荧光蛋白(最好是dGFP之类),用流式测滴度,很简单2 e8 F9 O) r% x6 L0 [
要么就用real-time PCR6 Q+ y+ s$ `: A/ P6 D
9 Q4 g3 ?2 E. y/ x% N5 f
基于抗原的elisa试剂盒也行,9 b! w+ M$ F2 C) s
但我个人不太喜欢,感觉不准,因为包出来后无感染力的病毒应该很多的

sunshy2772

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5 Q! v3 t( Q: y% i4 ^
: g/ q% ]8 C/ _测滴度好测定吗？我听说滴度不好测，我们实验室没测过~

wwwert

你们病毒用之前不titer吗？
* z5 k; _! B+ j6 t- @至少也要做个梯度啊