求助，逆转录病毒感染后MEF变圆，细胞漂~

sunshy2772

     我用Pmx逆转录病毒感染MEF细胞后，12小时后发现细胞基本都贴壁的很好，基本上没漂的细胞。但是，在换液后观察细胞变圆，有些细胞已经飘起来了。开始我以为是直接换干细胞培养液的问题，可是，今天我首先用MEF培养液换液，可是细胞也出现问题了~究竟是什么原因呢:'(% u3 h, p7 l6 t
     我用的病毒液是新鲜的，没有浓缩，4度下保存的，我想是不是因为病毒液用的多了呢？我用的是48小时收集的病毒液，每孔2mL感染的。盼望各位给予解答。我都快愁死了~  l9 v0 [2 Y1 k  z
     还有一个现象，就是细胞不贴壁。这是我做试验以来碰到的最大的问题，细胞养的好端端的，只换了一次液，就飘起来了；要不就是细胞状态不好，长的速度慢；要不就是，细胞一直长不起来，长着长着就漂了，一直找不到原因。养个细胞容易么:'(:'(

scottist

MEF细胞还是很容易养活的，所以很可能是病毒加多了。6孔板加的话，不必浓缩的病毒上清2ml/孔都算多的了，何况是浓缩过的，细胞顶不住了，所以就圆寂了，飘了。议测一下滴度，便于有的放矢。

wwwert

你们病毒用之前不titer吗？! Y# v7 b! e$ a; H, R% I! u4 s
至少也要做个梯度啊

sunshy2772

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, F8 @0 y: O& q  }- f9 f( j2 e
测滴度好测定吗？我听说滴度不好测，我们实验室没测过~

wwwert

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用双向载体最方便,一边表达目的基因,一边是荧光蛋白(最好是dGFP之类),用流式测滴度,很简单
# d5 q! v% O+ n$ q' h要么就用real-time PCR
% z! Q! Y9 ?3 _0 `& g, {0 W
0 A" C* F( u  t( x( B基于抗原的elisa试剂盒也行,1 ]; n4 g0 z. L- j: j1 s
但我个人不太喜欢,感觉不准,因为包出来后无感染力的病毒应该很多的

sunshy2772

回复 wwwert 的帖子! ]  ~. N! ^. o8 Z( x4 @$ r
  I5 U3 C& z; D1 l, x7 k8 \
谢谢你，我的是一个载体，如果和GFP两个载体是分开的话能用什么方法测定呢？
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大刀无敌

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你可以用相同的条件生产GFP病毒做对照，用同样的病毒量感染细胞，然后计数发绿色荧光的细胞数算出GFP病毒的滴度，进而估计出你实际病毒的滴度。

sunshy2772

回复 大刀无敌 的帖子- n: p2 w4 w- T- p( q
: d( u1 y# g; _/ N7 a' j
师兄是版主啊，呵呵:)

wwwert

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" {5 _  A; I) o+ A+ r' z; L) q# y3 `4 K- [* t% J8 D$ ^
这种情况我们一般是用realtimePCR来titer的, 原理和流式差不多7 w8 ~" F2 Z( \% ^* [1 w
就是作一系列梯度transduction, 然后取小于25%细胞感染的孔来计算titer（因为这时大部分转染的细胞都是单病毒）。
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我们是做基因治疗的，所以所有病毒都要求测实际感染的滴度
- \" H) R2 A4 o0 ]其实我觉得如果就是转一下细胞用没必要这么严格，直接用RT-PCR定量病毒总量就可以
: H& h0 h- F  _' ~有一片文献：http://www.nature.com/gt/journal/v6/n7/full/3300948a.html
9 E+ l1 D6 t! Y7 ?' v

cicadacjk

逆转录一般不会出现细胞大量死亡的情况，建议考虑其他培养过程的问题
$ E% L7 I4 y6 [% Y; O4 a4 n4 J0 L9 T另外，你可以只加1/10的c-Myc先看看，c-Myc太多细胞也是会凋亡的