求助，逆转录病毒感染后MEF变圆，细胞漂~

sunshy2772

     我用Pmx逆转录病毒感染MEF细胞后，12小时后发现细胞基本都贴壁的很好，基本上没漂的细胞。但是，在换液后观察细胞变圆，有些细胞已经飘起来了。开始我以为是直接换干细胞培养液的问题，可是，今天我首先用MEF培养液换液，可是细胞也出现问题了~究竟是什么原因呢:'(% Y4 R7 C6 V& |, x. F* D
     我用的病毒液是新鲜的，没有浓缩，4度下保存的，我想是不是因为病毒液用的多了呢？我用的是48小时收集的病毒液，每孔2mL感染的。盼望各位给予解答。我都快愁死了~
; }; s  Y- w1 n2 k     还有一个现象，就是细胞不贴壁。这是我做试验以来碰到的最大的问题，细胞养的好端端的，只换了一次液，就飘起来了；要不就是细胞状态不好，长的速度慢；要不就是，细胞一直长不起来，长着长着就漂了，一直找不到原因。养个细胞容易么:'(:'(

scottist

MEF细胞还是很容易养活的，所以很可能是病毒加多了。6孔板加的话，不必浓缩的病毒上清2ml/孔都算多的了，何况是浓缩过的，细胞顶不住了，所以就圆寂了，飘了。议测一下滴度，便于有的放矢。

wwwert

你们病毒用之前不titer吗？
& I" g( A5 w  q# B; Q至少也要做个梯度啊

sunshy2772

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& y% O6 K( {+ m$ k6 w测滴度好测定吗？我听说滴度不好测，我们实验室没测过~

wwwert

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& W; u$ j3 o! N7 z
6 ^- c, n9 i$ a' O7 R用双向载体最方便,一边表达目的基因,一边是荧光蛋白(最好是dGFP之类),用流式测滴度,很简单
# }) ~* i# G4 z: a& y要么就用real-time PCR
& [3 W/ W! p& G$ U& F( x& J- {# q! H9 {" G8 Y) s$ T
基于抗原的elisa试剂盒也行,/ T3 b+ f, k0 L- X2 E( L
但我个人不太喜欢,感觉不准,因为包出来后无感染力的病毒应该很多的

sunshy2772

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: b/ U( o5 C' ?8 p1 Y5 o' \' h! a
2 Y% n- r( `2 ]0 F- x6 A谢谢你，我的是一个载体，如果和GFP两个载体是分开的话能用什么方法测定呢？% ?$ B# |2 {4 E$ p8 f$ G8 F' i

大刀无敌

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) [9 a- S# |6 Z. n, I你可以用相同的条件生产GFP病毒做对照，用同样的病毒量感染细胞，然后计数发绿色荧光的细胞数算出GFP病毒的滴度，进而估计出你实际病毒的滴度。

sunshy2772

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  W3 k! E2 o! u& w5 J7 R1 J- i
6 }3 y  p& F+ i! s7 w7 N! z. V% W师兄是版主啊，呵呵:)

wwwert

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) R4 w8 f- S  `0 k' P! e0 X8 W( C0 ~2 b
这种情况我们一般是用realtimePCR来titer的, 原理和流式差不多! x, d) r3 @1 R+ h4 s7 w
就是作一系列梯度transduction, 然后取小于25%细胞感染的孔来计算titer（因为这时大部分转染的细胞都是单病毒）。
% C3 t$ j9 E0 x' \) a: K9 k: X0 X+ S9 Q( D4 t% ~
我们是做基因治疗的，所以所有病毒都要求测实际感染的滴度  b% ^7 z: K, Y
其实我觉得如果就是转一下细胞用没必要这么严格，直接用RT-PCR定量病毒总量就可以
4 B8 g, v" M, {0 Z% ^1 ?( X有一片文献：http://www.nature.com/gt/journal/v6/n7/full/3300948a.html
* s# b. Q1 ]. A

cicadacjk

逆转录一般不会出现细胞大量死亡的情况，建议考虑其他培养过程的问题7 ~% d# ^2 y) ~/ w1 A
另外，你可以只加1/10的c-Myc先看看，c-Myc太多细胞也是会凋亡的