求助，逆转录病毒感染后MEF变圆，细胞漂~

sunshy2772

     我用Pmx逆转录病毒感染MEF细胞后，12小时后发现细胞基本都贴壁的很好，基本上没漂的细胞。但是，在换液后观察细胞变圆，有些细胞已经飘起来了。开始我以为是直接换干细胞培养液的问题，可是，今天我首先用MEF培养液换液，可是细胞也出现问题了~究竟是什么原因呢:'(
% q$ @8 `7 j3 Q# _4 L9 ?     我用的病毒液是新鲜的，没有浓缩，4度下保存的，我想是不是因为病毒液用的多了呢？我用的是48小时收集的病毒液，每孔2mL感染的。盼望各位给予解答。我都快愁死了~
* l* M5 X+ I9 W$ \     还有一个现象，就是细胞不贴壁。这是我做试验以来碰到的最大的问题，细胞养的好端端的，只换了一次液，就飘起来了；要不就是细胞状态不好，长的速度慢；要不就是，细胞一直长不起来，长着长着就漂了，一直找不到原因。养个细胞容易么:'(:'(

scottist

MEF细胞还是很容易养活的，所以很可能是病毒加多了。6孔板加的话，不必浓缩的病毒上清2ml/孔都算多的了，何况是浓缩过的，细胞顶不住了，所以就圆寂了，飘了。议测一下滴度，便于有的放矢。

wwwert

你们病毒用之前不titer吗？
  Z+ l7 t1 }' w* J9 `至少也要做个梯度啊

sunshy2772

回复 wwwert 的帖子3 d) h# g/ ~) c+ y. W; b  K

+ \6 R7 u/ d  t! n9 v测滴度好测定吗？我听说滴度不好测，我们实验室没测过~

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子
/ n* E- E; ?# _
" Y& X; f' e5 D- V7 M用双向载体最方便,一边表达目的基因,一边是荧光蛋白(最好是dGFP之类),用流式测滴度,很简单7 `, k' E" F3 ^, X) ~* j
要么就用real-time PCR) H- I# a2 y/ Q; t3 f% B) v  o
. r) I" A/ b. `* Q0 b5 o7 A
基于抗原的elisa试剂盒也行,5 s5 N) }! j0 f* S% ^: ~7 K4 O1 S
但我个人不太喜欢,感觉不准,因为包出来后无感染力的病毒应该很多的

sunshy2772

回复 wwwert 的帖子) ?/ W; U9 D1 T1 E/ d* ?

3 ?( N+ p) @$ Q# @8 e谢谢你，我的是一个载体，如果和GFP两个载体是分开的话能用什么方法测定呢？9 F% H8 t( L! Z% g6 g- n

大刀无敌

回复 sunshy2772 的帖子
% h, X- s, d1 z8 x3 N. Z. @1 I' ]/ p8 h0 C2 {: b! \/ F( n& x9 z( \, t
你可以用相同的条件生产GFP病毒做对照，用同样的病毒量感染细胞，然后计数发绿色荧光的细胞数算出GFP病毒的滴度，进而估计出你实际病毒的滴度。

sunshy2772

回复 大刀无敌 的帖子
: N; [' D( P/ Q6 a7 T2 l# r
$ P$ U2 s2 s& y- f  p师兄是版主啊，呵呵:)

wwwert

回复 sunshy2772 的帖子
* k5 g& ?, c% H2 [: x" _6 Q( `6 }% c! w9 ]3 J% b% j; @
这种情况我们一般是用realtimePCR来titer的, 原理和流式差不多
% B/ T4 n+ Y/ a' H1 Q就是作一系列梯度transduction, 然后取小于25%细胞感染的孔来计算titer（因为这时大部分转染的细胞都是单病毒）。7 Y9 I/ [& V6 O% v

  n2 s# M, Q9 X. `0 Q# j9 `& Z我们是做基因治疗的，所以所有病毒都要求测实际感染的滴度
1 v" c4 o! a" C6 P其实我觉得如果就是转一下细胞用没必要这么严格，直接用RT-PCR定量病毒总量就可以
% y7 @( c  a; B/ i: k% T; M- `: N有一片文献：http://www.nature.com/gt/journal/v6/n7/full/3300948a.html( \3 ]" s- E3 r

cicadacjk

逆转录一般不会出现细胞大量死亡的情况，建议考虑其他培养过程的问题
6 D8 h7 N; L& E7 }另外，你可以只加1/10的c-Myc先看看，c-Myc太多细胞也是会凋亡的