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[讨论] 固定剂的选择 [复制链接]

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楼主
发表于 2011-7-20 22:48 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
    最近在总结一些固定剂选择的资料,觉得能用做固定的实在太多了。我想请问坛友们,做成骨的Alizarin Red S,软骨的Alcian Blue,脂肪的Oil Red O染色的时候,分别用什么固定液才能达到各自最好的效果?8 v8 R" W4 X: ]# {
抛砖引玉一下:1968年的一篇文章就说Alizarin Red S染色的时候先用酒精或者卡诺氏固定液最好,其次是甲醛或Zenker·s,但是甲醛的保存时间久了就会降低固定的效果。文章明确的说了,除非有必要的说明,否则,一般情况下,此项染色均应用乙醇固定。但是,现实中,我们经常用10%的甲醛或者4%PFA固定,这就忽略了最优化的选择。所以,我在这里发帖,是想请大家讨论一下各自的固定方法,顺便把自己的经验跟大家分享一下。
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沙发
发表于 2011-7-20 23:07 |只看该作者
回复 luoziwei 的帖子
' h# T! e3 P# a6 p7 y) j' C/ B' G. g5 O
最常用的是4%PFA,就是100mlPBS中加4g的PFA就行,需要充分溶解。
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藤椅
发表于 2011-7-21 09:08 |只看该作者
4%PFA,就是100mlPBS中加4g的PFA直接溶解是很难的; e+ [8 h1 B  _( x# H6 m; [" E
我们一般是4gPFA加入到约80ml的ddwater中,水浴加入至约60度,然后缓慢逐滴加入10N的NaOH,边加边轻轻搅拌直至PFA完全溶解,大概需要100-300ul的NaOH,然后加入10ml的10*PBS,调PH至7.4,补水至100ml,过滤,分装,-20度保存。OK了。用的时候直接化冻就行了。+ {6 w5 |5 a2 J- X% W4 t: p+ |
PFA有个致命的弱点就是不能固定时间太长,久了以后醛基回引起过多的蛋白残基交联而引起染色效果不好,并且醛基会带来自发荧光的假阳性干扰。这也是所有醛基类固定液的弱点。6 G; g/ J! e+ F, I6 o3 h
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runsong + 1 + 2 学习了
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板凳
发表于 2011-7-21 09:18 |只看该作者
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用中性缓冲甲醛就行了,基本上方方面面的染色都能适应。
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报纸
发表于 2011-7-21 09:29 |只看该作者
我没做过你提到的几种细胞,但是多聚甲醛的固定时间的延长对染色的效果会有影响。我们试用过文献上提到的一种AF固定液,能缩短固定时间,但细胞固定效果很好。; m) W% i4 T1 }' m( d
其100mL配方如下:PF(4%)+冰乙酸(0.25ml)+丙酮(10ML)即可.5 l- z9 f1 q, \' ~  e
括号内为终浓度或总含量.楼主可以尝试一下
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地板
发表于 2011-7-21 09:31 |只看该作者
回复 jhu132llh 的帖子
, q* {. M( L% S( |1 \
9 p1 P: Q8 S- r1 Y: e请教一下,我是直接把4gPFA加在100mlPBS,然后水浴65°过夜,第二天来了就已经溶解了。我这种方法行不行呢?
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7
发表于 2011-7-21 11:55 |只看该作者
可以呀+ j, d) `! [& H1 |4 q5 S* a( g3 C
怎么不可以+ c, u- R9 m+ l8 ?1 k; H& |
只要你不怕耗时长
' c! J5 ~0 ?# U2 Z* Q还有不知道过夜的65度会不会对PFA的性质有影响
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