固定剂的选择

luoziwei

    最近在总结一些固定剂选择的资料，觉得能用做固定的实在太多了。我想请问坛友们，做成骨的Alizarin Red S，软骨的Alcian Blue，脂肪的Oil Red O染色的时候，分别用什么固定液才能达到各自最好的效果？
) ^7 S  G: u7 l6 C! {! ]8 m抛砖引玉一下：1968年的一篇文章就说Alizarin Red S染色的时候先用酒精或者卡诺氏固定液最好，其次是甲醛或Zenker·s，但是甲醛的保存时间久了就会降低固定的效果。文章明确的说了，除非有必要的说明，否则，一般情况下，此项染色均应用乙醇固定。但是，现实中，我们经常用10%的甲醛或者4%PFA固定，这就忽略了最优化的选择。所以，我在这里发帖，是想请大家讨论一下各自的固定方法，顺便把自己的经验跟大家分享一下。

hcluo

回复 luoziwei 的帖子1 I* R' N3 T% h+ ^, _" t) _

, A6 _! f: _5 P最常用的是4%PFA，就是100mlPBS中加4g的PFA就行，需要充分溶解。

jhu132llh

4%PFA，就是100mlPBS中加4g的PFA直接溶解是很难的' B: y! t1 K" h
我们一般是4gPFA加入到约80ml的ddwater中，水浴加入至约60度，然后缓慢逐滴加入10N的NaOH，边加边轻轻搅拌直至PFA完全溶解，大概需要100-300ul的NaOH，然后加入10ml的10*PBS，调PH至7.4，补水至100ml，过滤，分装，-20度保存。OK了。用的时候直接化冻就行了。
; i+ ], ]  H- W: D9 SPFA有个致命的弱点就是不能固定时间太长，久了以后醛基回引起过多的蛋白残基交联而引起染色效果不好，并且醛基会带来自发荧光的假阳性干扰。这也是所有醛基类固定液的弱点。
% Z8 @: Q) A+ I& \; ]8 m; R6 p' y

gqs2872022

用中性缓冲甲醛就行了，基本上方方面面的染色都能适应。

james_0619

我没做过你提到的几种细胞，但是多聚甲醛的固定时间的延长对染色的效果会有影响。我们试用过文献上提到的一种AF固定液，能缩短固定时间，但细胞固定效果很好。; |7 |+ u7 l, B& y- p2 f
其100mL配方如下：PF（4%）+冰乙酸（0.25ml）+丙酮(10ML)即可.
2 G1 s. p# v, V% {9 F! Y括号内为终浓度或总含量.楼主可以尝试一下

luoziwei

回复 jhu132llh 的帖子) b$ l! x( ^, S; l$ {& G

' v$ j! w* @4 \请教一下，我是直接把4gPFA加在100mlPBS，然后水浴65°过夜，第二天来了就已经溶解了。我这种方法行不行呢？

jhu132llh

可以呀' a4 n% }* U+ {6 o9 D
怎么不可以
* Y- Q6 P- l" {" r. Z- h" n只要你不怕耗时长& `; q6 b% ^! n) p' I1 |
还有不知道过夜的65度会不会对PFA的性质有影响