固定剂的选择

luoziwei

    最近在总结一些固定剂选择的资料，觉得能用做固定的实在太多了。我想请问坛友们，做成骨的Alizarin Red S，软骨的Alcian Blue，脂肪的Oil Red O染色的时候，分别用什么固定液才能达到各自最好的效果？6 Q! ?; v5 `' |/ U+ |2 y  W& D
抛砖引玉一下：1968年的一篇文章就说Alizarin Red S染色的时候先用酒精或者卡诺氏固定液最好，其次是甲醛或Zenker·s，但是甲醛的保存时间久了就会降低固定的效果。文章明确的说了，除非有必要的说明，否则，一般情况下，此项染色均应用乙醇固定。但是，现实中，我们经常用10%的甲醛或者4%PFA固定，这就忽略了最优化的选择。所以，我在这里发帖，是想请大家讨论一下各自的固定方法，顺便把自己的经验跟大家分享一下。

hcluo

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! \/ s/ w6 N/ i) s* {9 r5 `+ o最常用的是4%PFA，就是100mlPBS中加4g的PFA就行，需要充分溶解。

jhu132llh

4%PFA，就是100mlPBS中加4g的PFA直接溶解是很难的0 {  E, [& e% X' B* |1 G9 f
我们一般是4gPFA加入到约80ml的ddwater中，水浴加入至约60度，然后缓慢逐滴加入10N的NaOH，边加边轻轻搅拌直至PFA完全溶解，大概需要100-300ul的NaOH，然后加入10ml的10*PBS，调PH至7.4，补水至100ml，过滤，分装，-20度保存。OK了。用的时候直接化冻就行了。
4 O9 T9 f- q; F6 `, t  K# H% }4 QPFA有个致命的弱点就是不能固定时间太长，久了以后醛基回引起过多的蛋白残基交联而引起染色效果不好，并且醛基会带来自发荧光的假阳性干扰。这也是所有醛基类固定液的弱点。
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gqs2872022

用中性缓冲甲醛就行了，基本上方方面面的染色都能适应。

james_0619

我没做过你提到的几种细胞，但是多聚甲醛的固定时间的延长对染色的效果会有影响。我们试用过文献上提到的一种AF固定液，能缩短固定时间，但细胞固定效果很好。/ ?# l. y5 \$ a) |; v0 D% y. P
其100mL配方如下：PF（4%）+冰乙酸（0.25ml）+丙酮(10ML)即可.0 e( C$ d" k1 S  X- k# D
括号内为终浓度或总含量.楼主可以尝试一下

luoziwei

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5 X+ ~. X/ U+ @& |; B5 W1 v7 O! s3 X( E; t2 G/ I: T
请教一下，我是直接把4gPFA加在100mlPBS，然后水浴65°过夜，第二天来了就已经溶解了。我这种方法行不行呢？

jhu132llh

可以呀- w  a- S3 V& Q: }
怎么不可以
' i3 z8 H- `9 u; P6 J2 h只要你不怕耗时长" f- [  C, ~) y! s9 S
还有不知道过夜的65度会不会对PFA的性质有影响