miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。6 L, M- Y$ Y( m9 o) ~" p3 B
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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( S2 c& }* ]9 ], U& v! Z

. t* I) _1 X* X+ ^大家看能不能参照这个2 Q5 y9 Y/ {: A1 K
siRNA 的转染（24 孔板为例） ' N! w0 P8 v8 h" F, H
I．准备细胞：
  L& J+ s/ k3 ~5 P! p贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  - S6 p* K) n* g; s" l. C# G. e
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
. N8 F' N+ D5 R7 U1 N+ A6 Y $ v2 A  O. q! N6 x
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： 6 C$ n7 U" r6 f2 _2 p9 \
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。 9 k2 }8 I5 s5 `! \
  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
  o5 d, ~( e4 t2 \# O0 T/ C  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  , x6 g1 n* ^- K' A  J& A* y
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  0 t  F5 h; g( h5 h" S( ^4 g2 l. W5 p# Q
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。' R  Y& d0 [: T8 `% |& B
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
3 a( D3 D" |8 Z- ]B. siRNA-RFect混合物准备：" t5 P7 d! J7 A5 }* ?) V. |
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
; `/ J. i# C7 \  c1 G2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
, D6 R. x) e& }6 H# i3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。$ M! B' q% [# v0 |+ ~$ A) k
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：( ?4 b+ c# R1 o+ \! N! n; ]! q
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
7 V4 p& T8 o4 m  y4 Q3 |0 Y7 q2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、1 e: a0 Z' ^% l1 _( m- S
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了