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1、取材% ]9 x( B! l0 U# f, H p
要挑选活力较好的部位，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。, {1 d& h0 ]' X" s. M M
2、培养基# K& [# m! I8 Z6 m4 q5 }( L
一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。9 t/ F' Y5 o3 z k7 Y+ G" X
1 ?9 D& @: e J8 @ W) G3、成纤维细胞的排除：
' c* `# Q2 i/ H7 K* n3.1 机械刮除法：' ?1 b( o2 z# l U! J% S
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
5 q0 V8 \& P1 v（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；2 [$ w6 [5 M+ v
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；2 y1 u& ~& U# i6 q0 v, A0 j
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
5 R. K# e! s4 A（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
9 v) s5 D* C2 u/ h3.2 反复贴壁法：+ ~9 x- t! W4 c8 Y" g- o& \; `
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。6 g3 Q; y) S9 W
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
# Q4 U: S) G/ p4 I9 T8 T$ y0 P- K! X1 z（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
# e6 V9 J- N; g; j（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。; P" f5 [* v E9 n! z
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
! C* a; M7 z/ V0 n3.3 消化排除法：5 I5 x' W& X- A: c0 i1 x
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
# _8 g) A2 m' I# j5 T8 r5 k% n1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；3 E1 b# N/ Z8 U1 w0 x' p$ a
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。' d5 t0 `9 B4 j& `' h
3.4 胶原酶消化法：
- I# ~) {; K) ^+ x5 M" N本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。( {9 F; Z8 W% U: V
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
w1 R3 w9 e0 e( H（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
% x0 D! A, O' `8 t) g K, N3.5 其它方法：6 D9 B9 Z/ }$ W% V! S2 x) ^
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
7 w: E6 x. ^1 {" q3 \选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
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4、操作( F& `) [( G& j/ p- h `) ]
用医用弯头剪刀剪切组织，然后用胰蛋白酶进行消化处理。9 `8 b0 ]* w5 Y/ y- A, x* M
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发表于 2011-8-1 10:35
