求教 群友高手

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 % D3 k- E1 q) ^& e
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

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什么叫扩增效率？
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# y2 q0 ]$ a. l2 @# T* R+ _' W% q( p, w在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

linlicau

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fwyou 发表于 2011-8-1 23:58
) ~" U3 X( X: `+ ]* i5 O回复 linlicau 的帖子
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呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

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5 y$ X1 ?5 L( ], w同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。: G5 B$ Y& ^. z  @

9 t8 Z' c0 ~6 ^' v$ L# h$ @在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），5 `( i! r( `7 M8 c7 h
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特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。1 s# E9 D2 a( `! m: d7 e4 I+ r

5 T3 K  }9 B1 L5 P/ `5 }$ X& s如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。
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7 z+ T8 E: _7 f$ q# R在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。