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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 4 V/ h4 r  G' {$ N! v
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

; A& }" t8 f0 x' r7 b7 j- p7 O9 C: U
什么叫扩增效率？
1 {+ U( h* ~& F% _
0 q7 o" O  C. j! F在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

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* _# ~- |% p# P8 a9 y" T1 T' w5 C& w( y- o
你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了! J) n& {7 |3 z) h
但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！1 a$ e( P+ S0 s: G
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？! E$ m! L: o2 e+ }$ F

! K, s) `7 q3 M$ n4 ^谢谢啊

fwyou

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5 q  f# F9 p3 K
+ v/ g* f" z0 J呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
5 o% u3 d/ E! }, X" _8 n每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？( S# e) [) u  {6 s2 Z- Z

* V* y6 ]6 H& r, |谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

' s! m2 @8 s# X& l6 g. q" p& F

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58
9 Y' J: M" U# q" N6 E+ N. B. E& k2 x回复 linlicau 的帖子
$ M# P- j9 N) Z, W3 X( z* y( p5 `) D# G  X8 I
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

3 M4 [1 B: @3 S0 Z4 n0 g$ {8 M  q7 q+ i2 h" _5 p
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。
+ P$ o4 U' k/ ], Z( O# f! u( c4 F/ l  ?
在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），
/ Q, j% Q" v) l, T0 g% v7 {+ E$ F( N
特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。& e3 B! Q1 P, k0 x
  v% T3 L+ Q5 Q9 A
如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。  M( ^2 r; X  [# r9 }: p0 c! _* ?9 g

# A! d- {# t4 c在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

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( d1 x4 ?& M- f7 y6 T5 C1 F2 v+ n4 ?) t( w$ i9 z
非常感谢 。。。。

echowdk

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" q2 w* Q* J6 P- L, U
% c5 Y/ R$ u1 R: C9 {在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次