求教 群友高手

fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 9 e- j+ Z6 Y& G" W8 `0 Z( v
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

) ~6 k+ k: x  V( l& k
什么叫扩增效率？
7 ~/ u) `5 c7 o5 k, a. t8 Z8 ]  B$ y, F8 f
在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

回复 fwyou 的帖子; y4 H& E  ~( C2 D# t; {
0 e; E4 Y- L) O+ Y4 X- t. K& v& e
你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了% j5 w- N9 ?: s
但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
. K  f) x6 y7 X$ k( U0 l. L+ c9 C9 T每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
2 ?$ z' Z' d0 X; E" t" l/ L
0 b  V2 t! e$ f( v' J8 p8 v谢谢啊

fwyou

回复 linlicau 的帖子
8 H" ^: c5 C9 l- k  N: j) F8 `9 _* j' }0 I5 f4 D5 f
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
$ @# `7 R9 |2 l8 {每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
7 X* J9 _6 I  t3 N% M* e' L0 w5 P
谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

% Q' F  T* I, R, ?- v+ I

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58 + G" q' C# V, j9 v& V( [$ {: p
回复 linlicau 的帖子
9 X3 _, K2 b4 Y& E( O9 S
" K4 Q; n* b8 F) p' F. K8 E" x+ ]呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

2 ?" [  b0 W" i/ G

) W- O- A( m: ]同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。& ?+ M3 T  Q+ b9 M& g0 a/ d) t4 a9 i
0 e4 C& Y" Y" W3 M
在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），7 G- N# }% q( e: o) ]( m
% _* ^# B8 T; A- T
特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。6 Q' B/ U/ {5 I) c

3 m0 j- r1 A8 D/ x如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。, i% h& S) A3 v2 D2 ~
9 ]  E! ^( Z- w
在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

回复 linlicau 的帖子
5 `5 p- s& M* D7 K& V1 ~+ _2 ?
5 W2 i, ~% R- k7 k1 `非常感谢 。。。。

echowdk

回复 fwyou 的帖子
/ z% k5 ?* Q# U2 i( J- ?# Z( M& y' v5 t6 B
在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次