为什么小鼠胚胎干细胞培养过程中成团漂浮？

dilal

最近一段时间，mESC培养过程中多次出现细胞成团的漂浮现象。我用的是CGR8系的小鼠胚胎干细胞，饲养层是自己原代提取的MEF（昆明小鼠孕鼠），培养基成分为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇，培养时加入1000U/ml 的LIF。起初怀疑是饲养层的问题，所以采用了无饲养层培养方法（明胶铺板）。把复苏的细胞分成三瓶，一瓶feeder+KSR培养基；一瓶feeder-free+KSR培养基；一瓶feeder-free+FBS培养基（80%knockout DMEM+20%FBS（Gibco）+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇）。2 Z1 E  V  ^1 V0 A
复苏后第一天：feeder+KSR培养基：mESC贴壁可，漂浮细胞较少，10倍镜下可见很小的细胞集落，细胞状态可；
0 r4 I! D" ]9 m* `! _! o3 A              feeder-free+KSR培养基：mESC贴壁差，漂浮细胞较多，贴壁的细胞多呈圆形，折光性差，感觉细胞缺乏活性；
( _' F# m8 B9 H# |0 U# L              feeder-free+FBS培养基：mESC贴壁好，漂浮细胞不多，细胞集落较大，贴壁的细胞呈圆形、条形，许多细胞出现了分叉（感觉有所分化）。
. y9 N) q, D) t) L复苏后第三天：feeder+KSR培养基：mESC出现大量漂浮细胞，漂浮细胞成团（偏黄），贴壁的细胞集落生长缓慢，而且边缘界限不清，feeder状态也欠佳，高倍镜下可见许多的黑色颗粒；
0 K! z" b1 S1 C              feeder-free+KSR培养基：mESC同样出现大量成团漂浮的细胞，贴壁的细胞多呈圆形，未见生长，折光性差，细胞状态很差；6 |7 J/ t1 f/ r
              feeder-free+FBS培养基：mESC漂浮细胞不多，细胞集落明显增大，分叉的细胞集落明显增加，分化比较严重，但未见有成团漂浮的细胞。2 d6 S# C. j- K( t. M# v
不禁产生以下疑问：1、为啥KSR培养基培养的mESC在复苏第三天都出现细胞成团漂浮的现象？是否跟KSR有关？) v9 A9 m/ R  ^# f( \# W1 Y. c  i- n
                  2、FBS培养基培养的mESC贴壁是否明显好于KSR培养基？为啥KSR培养基下几乎没有存活的细胞？0 y3 P  T0 X- ~0 h% N# w' N$ X
                  3、MEF是否存在支原体污染的情况？, F$ V$ w/ Z2 h- t9 F
                  4、我们复苏的mESC以前是用FBS培养的，是否是因为突然更换为KSR培养基，mESC不适应？
$ ^0 d% l& p' x; a1 b; `补充一下，我们用feeder+KSR培养基培养从广州生物研究所买来的miPS细胞时，也同样出现了细胞成团漂浮的情况，由于细胞来之不易，所以已经终止了iPS的培养。我们所采用的KSR培养基配方是广州生物医药与健康研究院提供的，KSR也是专门用于ES和iPS培养的。找的指定代理商买的，也不知道是不是KSR有问题。最近一直很迷惑，不知道下一步该如何是好。求高手指点，细胞养不好真的是耗时有耗力。

第七舰队

你在传代的时候，用的多大浓度的胰酶？消化多长时间? ' K- n3 M" Z# D/ \) j4 a4 x9 e

dilal

回复 第七舰队 的帖子9 u5 {/ f5 q- U: j0 D
8 W: E# W+ p! j* D" n% A# ~0 O
0.25%胰酶，消化了2-3min

christophe

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: R3 H! N$ \7 o6 i" z- j
/ p$ N9 o- G! }CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些，边缘也不如feeder上清晰，这都正常。
8 b+ `/ i) \* s' @我们是用高糖DMEM+15%FBS+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-ME+1%P/S+LIF.
9 b% W$ {' J! Y$ ]! M既然无feeder没问题何必要用feeder，还干扰实验结果；! `* b) G* z% Q8 J! f# y- T2 ]3 U
既然FBS就很好，何必要用KSR呢。

sapery279

虽然没有养过CGR8这种mES，但是KSR培养基在支持细胞贴壁（无论有无feeder）和促进细胞生长方面是比不上FBS，如果楼主用的FBS质量比较好，不会导致细胞分化的话，用FBS养还是不错的，如果会导致分化，最好还是在用FBS复苏或是传代过细胞之后，换成KSR培养基。另外feeder-free的情况下，FBS和KSR都会使克隆平铺下来生长，感觉状态不是很好。

luwei8157

christophe 发表于 2011-8-5 14:20 / S& I* _5 E% ?1 f4 N
回复 dilal 的帖子/ I2 W  D( Y, |4 p
2 a# H  A2 z$ }
CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些， ...

3 w* Z" F- t( s同意。我们也是同样的方法，而且你买细胞的地方，也是用这样的方法：）

dilal

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! M! s* K6 f9 r) W, E6 [
- h. U2 R$ X9 r& V; o/ A) H' \谢谢你的建议，我们用的是Gibco南美的血清，没有经过ESC培养筛选，感觉细胞状态比较差，细胞集落周边有分支及分叉，不像我们以前养的细胞集落一样形态比较规则，圆圆的，鼓鼓的，镜下看起来集落很均匀。怀疑可能是血清的原因引起细胞分化，所以才改为用KSR（专用于ESC培养）。不知道你用的FBS具体是什么，能否透露一下？

dilal

回复 sapery279 的帖子9 W* K& g$ b4 `& p) b8 ]7 i+ M

: h. S" _- T; J& ^3 n+ R6 c1 s的确是，我们培养了一段时间也发现KSR培养的ESC贴壁性较FBS差一些。你说的先用FBS培养再改为KSR培养，确实是一个好方法，我们将尝试一下。

dilal

问题已经得以解决了。在此向大家汇报一下：
( I2 a$ Q3 N, v9 `; U/ @. s我尝试了一下用广州生物医药与健康研究院寄细胞时多余的培养基（KSR）来培养ESC，培养前我先加入了一定比例的1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇（因为培养基放置超过了半个月），重新复苏了一瓶细胞，接种到无feeder明胶铺板的培养瓶中。复苏后第二天观察：大部分细胞都贴壁了，已有细胞集落形成，集落扁平，有些细胞周围有分枝。未出现前一批KSR培养基细胞成团漂浮的情况。3 i( K$ |( G& c  t8 a& P/ ^
重新复苏了一管MEF（P1代）：复苏后细胞存活率不到10%，大量的细胞漂浮，细胞状态差。换液培养2天后发现：细胞生长缓慢，镜下细胞显得很薄，细胞核内可见黑色的颗粒状物质，细胞质中可见许多聚集的亮点状物质，遮光性强，细胞膜上粘附有圆状亮点。+ I8 F/ M0 ?2 U* G8 i& k
重新配制KSR培养基，从而确定是否是血清替代物出现了问题。配制方法为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇。用该培养基培养传代后的mESC，与广州的培养基进行平行对比。今天观察细胞发现：细胞贴壁可，漂浮细胞较少，未见成团漂浮的细胞。细胞状态留待进一步观察。; p/ J5 g$ u/ V7 S6 g: M$ ]
目前推断：1、原先的KSR培养基可能存在污染，但单独将培养基放到孵箱里未见有污染迹象，怀疑存在支原体污染。
8 L. j, o0 x0 u6 K2 V/ O& ~/ z          2、原代提取的MEF可能存在支原体污染。依据：冻存细胞复苏效果差，复苏后的细胞显微镜观察结果像是MEF污染。
: Q  V0 x# C2 z0 ~2 z& Y& y; U$ C          3、KSR培养基污染可能来源于MEF，血清替代物本身未见污染（还需继续观察）。7 W  q( }+ Q( t+ r9 d& T8 x$ Q9 ~
由于实验室尚没有支原体相关的检测手段，上述推断也没法证实。下一步准备重新提取MEF，扔掉所有冻存的MEF和可能存在的培养液。看来正规的实验室培养程序还是很重要，如果当初我们对原代提取的MEF进行了支原体等相关检测，就不会耽误这么长时间。' |6 J) J' a; ?/ L# I3 D) m7 w( g# a
希望我们的教训能给大家一些帮助，如果大家有什么好的建议或者有价值的教训，以及自己实验室细胞培养过程比较完善的检测方法或者不足之处，可以借这个帖子共享一下。欢迎大家畅所欲言。

christophe

回复 dilal 的帖子+ o: u3 ]2 i( O, t

: y3 h$ e! a; }7 ~$ \我们用的是Millipore 的for ES 的FBS。$ {2 m( N; c8 ~- O' l" l
需要注意的是KSR在四度的保存期很短。
7 y5 o6 {# k0 H: I另外，你KSR的污染来源怎么会是MEF呢？