为什么小鼠胚胎干细胞培养过程中成团漂浮？

dilal

最近一段时间，mESC培养过程中多次出现细胞成团的漂浮现象。我用的是CGR8系的小鼠胚胎干细胞，饲养层是自己原代提取的MEF（昆明小鼠孕鼠），培养基成分为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇，培养时加入1000U/ml 的LIF。起初怀疑是饲养层的问题，所以采用了无饲养层培养方法（明胶铺板）。把复苏的细胞分成三瓶，一瓶feeder+KSR培养基；一瓶feeder-free+KSR培养基；一瓶feeder-free+FBS培养基（80%knockout DMEM+20%FBS（Gibco）+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇）。* ]9 k* {! a& m; d1 ]" ?9 b0 i
复苏后第一天：feeder+KSR培养基：mESC贴壁可，漂浮细胞较少，10倍镜下可见很小的细胞集落，细胞状态可；9 I' E4 Q7 W% ]0 R# a# `
              feeder-free+KSR培养基：mESC贴壁差，漂浮细胞较多，贴壁的细胞多呈圆形，折光性差，感觉细胞缺乏活性；: C6 B% ?, Y1 Q& ?4 N
              feeder-free+FBS培养基：mESC贴壁好，漂浮细胞不多，细胞集落较大，贴壁的细胞呈圆形、条形，许多细胞出现了分叉（感觉有所分化）。
6 ^& @3 i( ]. K  l/ ?复苏后第三天：feeder+KSR培养基：mESC出现大量漂浮细胞，漂浮细胞成团（偏黄），贴壁的细胞集落生长缓慢，而且边缘界限不清，feeder状态也欠佳，高倍镜下可见许多的黑色颗粒；' M6 }' @- B  @9 n: }! X; A
              feeder-free+KSR培养基：mESC同样出现大量成团漂浮的细胞，贴壁的细胞多呈圆形，未见生长，折光性差，细胞状态很差；
" j( n9 Q9 x; s! C6 J% l. P, T              feeder-free+FBS培养基：mESC漂浮细胞不多，细胞集落明显增大，分叉的细胞集落明显增加，分化比较严重，但未见有成团漂浮的细胞。* t0 I& v* U1 U/ T0 |
不禁产生以下疑问：1、为啥KSR培养基培养的mESC在复苏第三天都出现细胞成团漂浮的现象？是否跟KSR有关？& J* q7 l2 T' z
                  2、FBS培养基培养的mESC贴壁是否明显好于KSR培养基？为啥KSR培养基下几乎没有存活的细胞？! \8 o' J# S- D: {/ H5 k
                  3、MEF是否存在支原体污染的情况？1 S7 c( L# O; e2 ]  @
                  4、我们复苏的mESC以前是用FBS培养的，是否是因为突然更换为KSR培养基，mESC不适应？* k, r. Z" R) L; m" `+ x8 l7 S1 u
补充一下，我们用feeder+KSR培养基培养从广州生物研究所买来的miPS细胞时，也同样出现了细胞成团漂浮的情况，由于细胞来之不易，所以已经终止了iPS的培养。我们所采用的KSR培养基配方是广州生物医药与健康研究院提供的，KSR也是专门用于ES和iPS培养的。找的指定代理商买的，也不知道是不是KSR有问题。最近一直很迷惑，不知道下一步该如何是好。求高手指点，细胞养不好真的是耗时有耗力。

dilal

回复 第七舰队 的帖子5 c+ Q, V; z3 I6 w1 @
9 Q$ u0 q, b. C1 i& h5 v% @
0.25%胰酶，消化了2-3min

dilal

回复 christophe 的帖子
* r9 r: d. ?, t8 \8 T7 H. ]
( z, U! q3 O- V; O2 l. O$ Q! u! r谢谢你的建议，我们用的是Gibco南美的血清，没有经过ESC培养筛选，感觉细胞状态比较差，细胞集落周边有分支及分叉，不像我们以前养的细胞集落一样形态比较规则，圆圆的，鼓鼓的，镜下看起来集落很均匀。怀疑可能是血清的原因引起细胞分化，所以才改为用KSR（专用于ESC培养）。不知道你用的FBS具体是什么，能否透露一下？

dilal

回复 sapery279 的帖子! q+ |# I3 r8 L, u) b0 k
% h; ~( u4 O- Y& ^7 y( [2 Z
的确是，我们培养了一段时间也发现KSR培养的ESC贴壁性较FBS差一些。你说的先用FBS培养再改为KSR培养，确实是一个好方法，我们将尝试一下。

dilal

问题已经得以解决了。在此向大家汇报一下：& `# i3 F4 ^2 t
我尝试了一下用广州生物医药与健康研究院寄细胞时多余的培养基（KSR）来培养ESC，培养前我先加入了一定比例的1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇（因为培养基放置超过了半个月），重新复苏了一瓶细胞，接种到无feeder明胶铺板的培养瓶中。复苏后第二天观察：大部分细胞都贴壁了，已有细胞集落形成，集落扁平，有些细胞周围有分枝。未出现前一批KSR培养基细胞成团漂浮的情况。! @- q" a# Q+ }5 P: w/ e3 e4 Y
重新复苏了一管MEF（P1代）：复苏后细胞存活率不到10%，大量的细胞漂浮，细胞状态差。换液培养2天后发现：细胞生长缓慢，镜下细胞显得很薄，细胞核内可见黑色的颗粒状物质，细胞质中可见许多聚集的亮点状物质，遮光性强，细胞膜上粘附有圆状亮点。
1 L* |& K- M: Y重新配制KSR培养基，从而确定是否是血清替代物出现了问题。配制方法为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇。用该培养基培养传代后的mESC，与广州的培养基进行平行对比。今天观察细胞发现：细胞贴壁可，漂浮细胞较少，未见成团漂浮的细胞。细胞状态留待进一步观察。! {7 a9 R. B% ], [: y
目前推断：1、原先的KSR培养基可能存在污染，但单独将培养基放到孵箱里未见有污染迹象，怀疑存在支原体污染。
' @- B9 y* H% W          2、原代提取的MEF可能存在支原体污染。依据：冻存细胞复苏效果差，复苏后的细胞显微镜观察结果像是MEF污染。! i# B# J( S- k1 ?3 N
          3、KSR培养基污染可能来源于MEF，血清替代物本身未见污染（还需继续观察）。
/ F9 A8 a3 M$ l! ]0 @0 k, e由于实验室尚没有支原体相关的检测手段，上述推断也没法证实。下一步准备重新提取MEF，扔掉所有冻存的MEF和可能存在的培养液。看来正规的实验室培养程序还是很重要，如果当初我们对原代提取的MEF进行了支原体等相关检测，就不会耽误这么长时间。% x0 m/ h% u( g1 a
希望我们的教训能给大家一些帮助，如果大家有什么好的建议或者有价值的教训，以及自己实验室细胞培养过程比较完善的检测方法或者不足之处，可以借这个帖子共享一下。欢迎大家畅所欲言。

dilal

回复 christophe 的帖子
# a9 D4 b# o8 t' I" M! ^) T5 v- R; v3 k0 ?
怀疑是KSR培养基在MEF培养过程中发生了交叉感染，具体怎么污染的也不清楚，只是猜测而已，因为缺乏支原体检测手段。

dilal

回复 573639471 的帖子( C8 K/ \' T1 @( c
8 e" ~7 T$ z  Q3 ^! M
有些个别细胞系的ESC可以用无feeder培养，但是细胞相对于feeder培养容易分化，不适合长期培养。不过无饲养层培养将会是未来干细胞培养的趋势。