关于双酶切

huangcong1988

提了质粒之后测了测浓度，虽然不高（大概两三百），但是应该还能用，就双酶切，但是最后跑胶发现除了marker，就没有带了，不知道为什么，按理说即使没切开，也应该有带才对啊？很奇怪，两三百纳克每微升应该还是有比较亮的带吧？点了也不少（4微升）

zzc2211

质粒提取后，可以测浓度，个人认为最为保险的是跑胶鉴定，建议楼主在双酶切前先跑胶看一看质粒有无，确定有质粒后再双酶切。提取的质粒可受到蛋白、RNA等物质的污染，也可能就没有。测浓度时，DNA、RNA的最大吸收波长260nm，蛋白质280nm，残存的盐和小分子杂质230nm。OD260/280值估计核酸纯度，纯净DNA260/280比值约为1.8（大于1.9表明有RNA污染，小于1.6有蛋白质和酚污染），OD260/230估计去盐程度。OD260/230应大于2，OD260/230小于2说明去盐不充分，可再次沉淀和70%乙醇洗涤。纯RNA OD260/280值在1.7～2.0，小于1.7有蛋白或酚污染；大于2.0有异硫氰酸残存。2月前个人曾碰到同样问题，跑胶验证后质粒非常少。希望有所帮助。

zzc2211

质粒提取后，可以测浓度，个人认为最为保险的是跑胶鉴定，建议楼主在双酶切前先跑胶看一看质粒有无，确定有质粒后再双酶切。提取的质粒可受到蛋白、RNA等物质的污染，也可能就没有。测浓度时，DNA、RNA的最大吸收波长260nm，蛋白质280nm，残存的盐和小分子杂质230nm。OD260/280值估计核酸纯度，纯净DNA260/280比值约为1.8（大于1.9表明有RNA污染，小于1.6有蛋白质和酚污染），OD260/230估计去盐程度。OD260/230应大于2，OD260/230小于2说明去盐不充分，可再次沉淀和70%乙醇洗涤。纯RNA OD260/280值在1.7～2.0，小于1.7有蛋白或酚污染；大于2.0有异硫氰酸残存。2月前个人曾碰到同样问题，跑胶验证后质粒非常少。希望有所帮助。

like_gj

用提的质粒加loading直接点样做对照

wang3033

1.内切酶的质量如何？是否酶加的太多，可能酶产生了*活性，导致质粒被水解" z0 ^. d2 c. U6 B! A3 u+ _: A( T
2.你的质粒是否是PET系列的，该类质粒本身就是低拷贝质粒
+ p  S6 N  D- T$ H3.内切酶选的对否，是否在MCS外还有酶切位点？  x- [5 V! ?- _, P
4.内切酶作用时间不要太长，差一点的内切酶过夜消化经常效果不好

huangcong1988

回复 wang3033 的帖子8 O, b2 o+ D5 Z$ E8 ]
6 c% G. p/ T4 r! X
谢谢，感觉第二种推测有可能，不过转化的效果就不太好，可能那也有影响

huangcong1988

回复 like_gj 的帖子/ o. G1 A4 L% ?: ^3 ^' Q; [" k

7 r. A) Z  j$ Y  G5 |8 P正准备这么做呢，呵呵，不过即使没有切开，也应该有带才对，挺奇怪的

huangcong1988

回复 zzc2211 的帖子
: M* M6 O/ w* T1 Z  {# |0 ?6 X, b2 G; s/ B4 U
谢谢，我测了浓度，三百多，OD比值也很正常，1.9左右，但还是没带，准备直接质粒加loading buffer 跑一下看看

zzc2211

回复 huangcong1988 的帖子
9 R& A1 Y' o; e- J6 ]; f7 i$ g
' o: H) k6 X+ C( ?$ K! [有结果告诉我一声，谢谢，共同进步

huangcong1988

回复 zzc2211 的帖子4 G4 z6 c$ K# j- _$ G9 W

* I, m3 E0 r* B% s6 G: i4 T我又做了一遍，浓度是1000左右，就是1微克每微升，比较高，但发现还是没带，提的质粒也没带，这个。。。