ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

yangel

rongrong 发表于 2011-9-4 11:45
+ z/ ^9 Z. ?) u0 R大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺 ...

; i8 P: T+ I* B; A: l0 ]做的没错！复苏成这个现象也正常，再养几天看看有没有小的ips clusters长出来。要提高复苏效果的话用Y-27632处理24h。

hnczlw48005

复苏温度应该在37°，冻存干细胞时的血清很重要，最好用进口血清，浓度越高越好，可以用90%FBS+10%DMSO作为冻存液。

jiefengbing

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( O8 n) W( @: |# Z
0 Y# j1 w, H1 [/ I5 V/ f2 k) H1 ywicell 复苏ES不需要离心？正好我手头上有一份，200g离心5min,然后gently re-suspend cell pellet.不知道您的步骤是哪个版本，可否让我看看？

rongrong

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7 H9 S7 _" W/ L恩，好的，谢谢鼓励啊，继续前行再接再厉

evial

FBS：DMSO=9:1你的浓度低了

oucflora

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/ a' y4 W8 Z& c* R) F
/ R7 ^/ C; |  |% ~  ^$ P! H在-80度放置两天对细胞成活率影响不大，倒是液氮量特别少，会导致细胞死亡较多。
/ M! H1 R6 S8 I) l. A% C# h: h: F2 v/ h" a& u# g# W
补充内容 (2011-9-5 20:27):1 R( S* N0 p' F6 U! C# \$ W7 v3 X2 Z" y
不过如果你们的液氮罐是保温较好的进口的话，影响倒是不大* y7 A/ f0 Q& o. h, e
' z8 g* e( M+ u1 B+ E) y
补充内容 (2011-9-5 20:28):+ j% v) A: |* w% ~
“进口”的意思是“非国产”

oucflora

回复 rongrong 的帖子7 p5 Q+ w2 H" c+ l8 Y& h

  n5 ^* w' s, T0 U8 f, n20%,曾经一个师兄用过更高的浓度，大概30%，细胞情况也挺好。

cicadacjk

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2 F4 s2 D- r1 x) M& A! Q- j
. a$ j! n, c$ `6 A这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的
& L; D" u9 m7 d2 |9 y1 F对jefferson就没必要这样了吧
; W) \* i0 }2 w2 F/ u# k6 n0 q. B2 ^Y27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。
, m: z) m/ t5 |至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。* c7 |! \8 [( q% h" f  s" ^, q
. D5 y) |% s( C+ l4 O+ s
按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。

张也行

回复 rongrong 的帖子& J& V# d6 y& n
: e( {. }6 x# x1 H0 Q! g) E9 u* T3 q
做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。