请教迅速高效分离卵母细胞的方法

moluxingke

由于实验需要，打算从刚出生不久的小鼠（PD3-PD14）卵巢中分离卵母细胞，向大家请教一下分离方法，下面是我看文献整理的一些步骤，感觉所需时间较长，大家有没有其他的更为有效的方法？望不吝赐教，谢谢。! N$ O& m% }! g9 A/ v

  k7 o" a$ a2 B1 小鼠脱颈处死，取出卵巢，在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。' H. q9 `; N5 N8 u% K
2 将卵巢剪碎，然后胶原酶消化，消化过程中不断吹打振动。$ i+ I# |3 Q0 h+ {# v7 z6 `& G7 {
  胶原酶溶于DMEM/F12培养基中，浓度为0.05%，培养基添加0.4%（g/ml）的BSA，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，7 G& P# z5 ?- m, v: t: q  i
3 大约40-60min以后，待组织消化基本完全，往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM，然后于37℃孵育15-20min，期间不时搅拌，直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。
- z' @' O, n1 L% @4 将细胞混合液洗涤一次，然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h，使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长，未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中，室温1000rpm离心5min，然后血红细胞经过低渗buffer出去，（含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2）。; |% c5 r! H0 P9 z
5 洗涤几遍以后，离心收集卵母细胞，加入裂解液裂解后，14 000rpm 离心20min，4℃，取上清测BCA法蛋白浓度，待用。. ~! z% x7 _# s( l
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        具体方法参见：   Pradeep Reddy, et al.  Science，2008) _9 c( f& N! P) i8 v1 n

moluxingke

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嗯，谢谢，不过我有时候需要的是一些较为早期的卵母细胞，比如原始卵泡库刚刚建立或是次级卵泡之前的阶段，那个时候卵泡对激素的应答能力还比较低，呵呵，感谢你的帮助。