成熟脂肪细胞培养

biocyclin

最近刚开始接触大鼠脂肪细胞培养（成熟脂肪细胞与脂肪基质细胞），一直不是很好，高手能否指点下

细胞海洋

请详细说明你的实验问题 大家才能帮你找问题

biocyclin

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% n9 f0 v: L+ Y6 L
" A& e6 X/ u4 \就是成熟脂肪细胞用天花板法倒置培养过夜，贴壁的很少

lidaifu001

成熟脂肪组织，可以用消化法做，贴壁的还行，您可以试试。

anti

不知道你用的什么倒置培养方法。要是用培养瓶的话培养基是要充满培养瓶的只留大约2ML的空间加入成熟脂肪细胞。
6 l) Y. y# Y! M! a7 `( L8 z- u  J1 提取小鼠脂肪组织后先用生理盐水清洗干净，剔除血管，结缔组织等（有助于初步纯化细胞，后面步骤提取出的成熟脂肪细胞比例会比较大）。用剪刀剪碎，（细碎的组织有利于细胞爬出。）, [; y4 J- E. L/ g9 `* R
2 用0.075% I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀。.$ }; Y) X; n4 K0 g! M6 ]
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。
3 F7 k4 f1 n+ s7 x- n1 \4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。（成熟脂肪细胞体积较大，直径大约在100~200微米左右，在光镜下成发亮的球形）
. N4 y: ?( k9 d/ G5 F3 @5 135g离心3min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是SVF）
$ J% D9 N4 Z- S- H6 离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，135g 3min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）% ^1 F& i) s) P- i
7 将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。6 `, t  d5 ]. d7 F4 {- U9 ~* W
8 接种密度 5×104/T25。
1 z3 L, [6 Y- W4 {* O% p9 接种时培养基基本充满培养瓶。
/ T% H+ r8 E9 q6 d( [9 Q5 f; G10 倒置培养，最好选用没有透气膜的培养瓶，否则会漏液。5 e0 W7 P2 P9 _0 F0 @1 q
11 一般10~14天去分化，期间不要换液，前几天细胞贴壁不牢时也不要触动培养瓶，防止刚贴壁的细胞脱落。" Y1 B/ i8 Y: Q
12 细胞贴壁后方可正放培养瓶，正常换液培养扩增。
& E" }* P8 a& ]* `: \$ d0 R  G/ H( E' P9 ~8 I% ]* S  g8 `

anti

如果对去分化脂肪细胞的纯度有很高要求，可以进行多次短期倒置培养提纯。9 P& l# |- q1 d  y
与楼主共享几篇文献~
$ J' R! P) q) P+ P' `% v希望楼主成功。

dzj121

回复 anti 的帖子% l3 A8 v- m4 U2 L- a

" ]' _; x0 j, R. I0 V0 n' E7 p8 q10-14天都可以不换液么？没气体交换怎么办？带滤膜的瓶子可以不漏液体的哇

anti

没事的如果你用带滤膜的就要用封口膜把口封好，不然一定会漏的。14天不换没有事，毕竟一个T25装满有将近70毫升的。再说了，你换的话也换不了，要不刚贴的细胞就会掉下来了。你要等它贴牢了再换。
9 z- y  G$ _7 p* P. X& \9 U2 N' t

biocyclin

感谢，试试

biocyclin

回复 anti 的帖子/ v. o) t, X7 `* Q* d

' U* ^- @( A+ f3 k血清浓度是多少对实验影响大吗，我看有很多种浓度的，有的说20%，有的说10%，还有的说血清浓度高了，对细胞有影响，只用1%的