关于反向PCR

军医

最近一直在做反向PCR，P出来的总是弥散的带，不知道是引物与环化后的DNA不匹配，还是条件要改进，哪位大侠给指点一下，附上电泳图。

yeya

我在反向PCR的时候，也出现过这样的情况。总是一段时间内可以P出很好的条带，但是有一段时间总是smear，也不知道是什么原因，很郁闷，只有不断换条件。我的经验是：1 感觉比较有用的方法是PCR后取少量样品跑胶，看是否是smear，如果是，那么把剩下的样品直接做PCR纯化（相当于胶回收），然后分别稀释成1：100,1：1000,1:10000等梯度，然后作为模板再次inversePCR；2 体系中加BSA；3 换酶，有时候可能Taq可以出，有时候用KOD plus吧，有时候在可以用KOD plus new，只要能出带就行；4 inversePCR很重要的是它的反应体系貌似太容易受到外界的影响了，很脆弱，稍微的改变都有可能P不出来，所以要做到：引物、dNTP、buffer等都分装成一次性的，P一次用一次，不要反复的冻融这些东西；引物一定要用两个月内的吧，不要太久；5 最后，P不出来那就把所有的东西都换新的，试试，我做的时候有一次把所有的东西都换了，结果就P不出来……唉，反正inversePCR很伤不起……有时候RP很重要，呵呵……! k8 s; C8 x  i* O) ~8 g, ~

yeya

还想起来一点啊，你做自连环化的时候一定要16度过夜啊，用PCR仪做连接吧，哈哈，条件很苛刻……

军医

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! `0 D5 h3 h! J& ?) K5 E, j3 f7 m" g# k' o
我一直以来都是在4度里连的，一般连好几天，图中这样的情况是不是可能会P出来，需要改变条件呀，谢谢了

yeya

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5 }7 ^8 v5 H2 O' E# f我以前4度连过夜，出来时smear……连好几天到没有试过……

军医

回复 yeya 的帖子  }& k) L8 V! |/ n8 y* p- n0 P

* J) c" r) a3 t) q9 R; D那我16度连接试试，谢谢！

279042256

，学习了

军医

回复 yeya 的帖子- @* m+ S- _# L4 ^7 G6 Y

  p" g9 H: C1 c: ?& n: T我把自连的产物转化了，但是要的菌液里提不出质粒，你遇到过没有呀？

yeya

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& e0 V; p: l/ U6 r: d4 e
) P4 K  F: g8 L# v我没有那样试过啊，我是从基因组上PCR出片段，然后酶切后自连，自连产物都直接PCR了啊，自连产物你可以定量看看是否正常。要是你是从基因组上P出来的片段那么提取的基因组DNA好不好也很重要。

军医

回复 yeya 的帖子# T( q8 v2 U2 X3 `% T) O) X

9 s8 S5 G( p# A9 K- O5 J我是先酶切基因组再自连成环，拿连接产物做PCR，总是P不出来，我是要检测外源基因插入到基因组的什么地方。