小鼠脂肪干细胞纯度问题~

yunxinxu

经过几个小时，本人基本浏览所有人的帖子，关于脂肪干细胞原代分离培养的方法基本都一样，只是个别出现了培养过程中细胞状态的差异，这些问题似乎都已经随着经验的提高一一解决了。可是，我还是想问个大家似乎没有提到的问题：. ^7 N# A" R" B) A* d2 P
1.原代分离出来的贴壁细胞中，都包括什么细胞？干细胞到底含量多少？随着代数的增加，干细胞纯度有没有改变？改变有多少？有没有做过流式的数据？, t" O+ T0 h$ \! {& D- D
如果这些经验数值我们都不知道，叫它干细胞，有点牵强吧？至少纯度不够。4 Y! {7 }0 A! C( ^3 W  r, x
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2.是不是向别的特定细胞分化前，必须经过流式，尤其是要向功能细胞分化而且用到临床上，是不是细胞很纯以后才能诱导？/ l! @4 l5 u8 X2 o# [- L4 f" U9 [
  当然，如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以。
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/ ~3 q  \# B/ P9 v3、脂肪干细胞向特定细胞分化前，对其Marker又没有统一标准，大家该如何选择？
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, J- w4 y. k2 @0 R' P9 Z4 H
- }2 N  Z7 s3 o请有经验的研究员介绍一下吧，很疑惑也很期待！

anti

我查了下文献，从脂肪组织中原代分离出来的干细胞成分中含有成熟脂肪细胞，前脂肪细胞，成纤维细胞，血管平滑肌细胞，内皮细胞，固有的单核和巨噬细胞。还有研究表明还含有淋巴细胞。; b1 V( y8 n) }1 g( B+ Q4 w# P- S
具体的你可以参考：Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.   
5 R$ h& R9 w+ S9 n' C- f4 ^% Z. zObesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.
% ~5 J" }6 ^) S; D0 z还有Adipose tissues as an ancestral immune organ: site-specific change in obesity.
% L/ l: Z7 a7 [9 E7 U文献 这几篇是网页形式的我没下下来，楼主自己去找的看吧。
+ |( S' A2 _2 p2 q我开始做脂肪干细胞的时候也有同样的疑问，没有足够的纯度怎么能达到好的疗效呢。现在做干细胞美容的越来越多，虽然患者注射了细胞，但细胞的成分那些医疗机构自己都说不清楚，无非是坑害消费者。做科研就要像楼主一样有颗严谨的心啊~
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anti

置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

yunxinxu

谢谢以上两位研究员，希望经验更丰富的研究员给更多的支持！

meister

间充质干细胞纯化有几种模式。
+ x# d# |0 f6 R1. 传代培养$ @5 s, U5 |6 a$ E5 D1 z  y5 W4 f( F
2.流式分选
; k; X. f, {7 a; g8 P! Q& f7 D3.磁珠分选。2 y  A/ T) _3 y6 Q- v
常规分离方法得到的间充质干细胞纯度较低，经以上方法纯化后，可以使纯度达到90%以上。& O+ r; g* ]% ?4 |! I

都市青蛙

anti 发表于 2011-10-12 13:03 4 K6 Q4 u' ~3 t  `
置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

; j$ w/ s; g- G2 p8 @的确是传代后CD105表达降低了( R; H1 c7 {& T# O; Y; p
文献上有提到这点" ^( q/ F* d  _6 W
我自己做的也发现这个问题了

namulow

ADSC尚未发现特异的marker, 因此目前并无法纯化为单一细胞系

zerollx

1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯长最终淹没干细胞，分离程序不完善，也会引入各种和更多的杂细胞。目前常规的培养体系中，原代贴壁细胞主要有内皮细胞（来自于血管，原代剔除血管和后期传代操作可去之）、造血干细胞（来自于血液，调整首次换液时间可去之）、脂肪细胞（洗涤不充分或洗涤方法错误引入，充分洗涤，洗液从表面吸弃，三次洗涤可去之）等；随着代数的增加，纯度是否有改变得看你的传代方法了，前三代传代最重要，得利用杂细胞与干细胞消化所需的时间上的差异来逐代纯化，三代以后纯度就相当高了。
4 K- Z7 V0 x! j3 G4 c& V5 J% Q+ F2、是否必须过流式，你发文章时编辑可能会问你，若你没做可能不好解释；用于临床最好还是严格点，因为对于种子细胞的必须得有清晰的背景，而且用于临床的细胞，对其纯度要求是非常高的，这里的纯度不仅只种子细胞的纯度，还有诱导后目的细胞的纯度，没诱导成功的干细胞与诱导后的细胞混杂注入治疗，很可能致瘤，这也是ES细胞用于临床治疗的瓶颈所在，不过最近报道的PHA纯化可以很好的减弱这种影响。/ }# Q+ \6 M' q" T+ t: p
  对于你说的“如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以”，个人认为不合理，原代分离的脂肪干细胞中有很多的杂细胞，也可能有造血干细胞，你没有用流式鉴定细胞纯度，没有剔除杂细胞的影响，诱导后的细胞你能说一定就是由脂肪干细胞诱导而来的么？这就造成了一定的不严谨性。
; R5 X- O: M% p( ^% s3 t3 B& a( b( A$ m  P, f( C* m7 H( S
3、脂肪干细胞没有特定的Marker，一直是其鉴定的掣肘，所以目前的同一的鉴定方法是三个方面相互辅佐共鉴之，我想你也应该看到过相关的资料：即贴壁生长、强自我更新能力，间充质来源干细胞Maker高阳性表达，三系分化，这是目前算是最严谨的鉴定方法了。% T  L1 a; q' u; F+ R- C
   个人拙见，希望对你有帮助……8 N  `& N& g! |% M. o4 S
  E: W/ X5 p, d0 ^

namulow

zerollx 发表于 2011-11-13 00:31
: r* A1 Q( ?9 @1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯 ...

# }6 e- o4 |3 _, q( S* h- _受教了，很详细。
) F) ?( |( d. I. c5 u  z6 k  E补充一点：关于脂肪干细胞鉴定，多向分化能力可以加以证明，目前主要有两种办法：1，体外诱导向成骨、成脂、成软骨等各个方向分化，通过染色观察其表达相应目标细胞蛋白，进而证明诱导分化能力。2，将干细胞复合支架材料植入裸鼠体内，可以成瘤，含有多种组织类型，也可以证明脂肪组织来源的细胞中含有多能细胞。

相宜

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今天才看到这么好的回复，受用了，谢谢