小鼠脂肪干细胞纯度问题~

yunxinxu

经过几个小时，本人基本浏览所有人的帖子，关于脂肪干细胞原代分离培养的方法基本都一样，只是个别出现了培养过程中细胞状态的差异，这些问题似乎都已经随着经验的提高一一解决了。可是，我还是想问个大家似乎没有提到的问题：) y& d9 |! K2 @7 R$ a/ h8 ]
1.原代分离出来的贴壁细胞中，都包括什么细胞？干细胞到底含量多少？随着代数的增加，干细胞纯度有没有改变？改变有多少？有没有做过流式的数据？& s- s1 h3 A" B) V( A2 D
如果这些经验数值我们都不知道，叫它干细胞，有点牵强吧？至少纯度不够。
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2.是不是向别的特定细胞分化前，必须经过流式，尤其是要向功能细胞分化而且用到临床上，是不是细胞很纯以后才能诱导？
" A9 r4 e$ e9 U# P  当然，如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以。8 T- C  b4 P$ h" `0 W8 u
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3、脂肪干细胞向特定细胞分化前，对其Marker又没有统一标准，大家该如何选择？
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请有经验的研究员介绍一下吧，很疑惑也很期待！

anti

我查了下文献，从脂肪组织中原代分离出来的干细胞成分中含有成熟脂肪细胞，前脂肪细胞，成纤维细胞，血管平滑肌细胞，内皮细胞，固有的单核和巨噬细胞。还有研究表明还含有淋巴细胞。
6 w1 X' Y  o$ |* o具体的你可以参考：Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.    2 g$ D' }, a5 G7 m1 M
Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.
5 Z7 ]& k+ M) y4 I. Q还有Adipose tissues as an ancestral immune organ: site-specific change in obesity.
" k7 n$ k0 ^' Z( U* H文献 这几篇是网页形式的我没下下来，楼主自己去找的看吧。' E# {) B# Q* c" E3 g- F, i
我开始做脂肪干细胞的时候也有同样的疑问，没有足够的纯度怎么能达到好的疗效呢。现在做干细胞美容的越来越多，虽然患者注射了细胞，但细胞的成分那些医疗机构自己都说不清楚，无非是坑害消费者。做科研就要像楼主一样有颗严谨的心啊~
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anti

置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

yunxinxu

谢谢以上两位研究员，希望经验更丰富的研究员给更多的支持！

meister

间充质干细胞纯化有几种模式。
4 R! ?! B; ^" {: z5 ^1. 传代培养
3 J8 J9 a7 I- d& \: ?+ ^2.流式分选
* _" {/ p) O5 ~% O9 y' U3.磁珠分选。; D1 K, S: ?& F) |$ P# l
常规分离方法得到的间充质干细胞纯度较低，经以上方法纯化后，可以使纯度达到90%以上。8 R( @# b& q. w

都市青蛙

anti 发表于 2011-10-12 13:03 0 j. U. m- w' P  B! {) u. C9 D
置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

8 N. Q( }1 b" `8 y+ q: l
的确是传代后CD105表达降低了0 Z4 O1 X( F, f4 R- @. `8 z
文献上有提到这点
$ `+ ~4 C9 `5 I. d( p我自己做的也发现这个问题了

namulow

ADSC尚未发现特异的marker, 因此目前并无法纯化为单一细胞系

zerollx

1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯长最终淹没干细胞，分离程序不完善，也会引入各种和更多的杂细胞。目前常规的培养体系中，原代贴壁细胞主要有内皮细胞（来自于血管，原代剔除血管和后期传代操作可去之）、造血干细胞（来自于血液，调整首次换液时间可去之）、脂肪细胞（洗涤不充分或洗涤方法错误引入，充分洗涤，洗液从表面吸弃，三次洗涤可去之）等；随着代数的增加，纯度是否有改变得看你的传代方法了，前三代传代最重要，得利用杂细胞与干细胞消化所需的时间上的差异来逐代纯化，三代以后纯度就相当高了。
* u5 |; L( n! t2 U/ `) D2、是否必须过流式，你发文章时编辑可能会问你，若你没做可能不好解释；用于临床最好还是严格点，因为对于种子细胞的必须得有清晰的背景，而且用于临床的细胞，对其纯度要求是非常高的，这里的纯度不仅只种子细胞的纯度，还有诱导后目的细胞的纯度，没诱导成功的干细胞与诱导后的细胞混杂注入治疗，很可能致瘤，这也是ES细胞用于临床治疗的瓶颈所在，不过最近报道的PHA纯化可以很好的减弱这种影响。
; p) x' g3 R8 r, L6 u! Q  对于你说的“如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以”，个人认为不合理，原代分离的脂肪干细胞中有很多的杂细胞，也可能有造血干细胞，你没有用流式鉴定细胞纯度，没有剔除杂细胞的影响，诱导后的细胞你能说一定就是由脂肪干细胞诱导而来的么？这就造成了一定的不严谨性。
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3、脂肪干细胞没有特定的Marker，一直是其鉴定的掣肘，所以目前的同一的鉴定方法是三个方面相互辅佐共鉴之，我想你也应该看到过相关的资料：即贴壁生长、强自我更新能力，间充质来源干细胞Maker高阳性表达，三系分化，这是目前算是最严谨的鉴定方法了。, Z+ y) \; [3 }5 J6 a* u1 [6 H
   个人拙见，希望对你有帮助……0 O/ T9 z$ k# G  O6 I6 Y) z# h
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namulow

zerollx 发表于 2011-11-13 00:31
! N& V: E9 [( \4 {; @' r& y* Z1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯 ...

, f+ W4 W: i" @! ^; u
受教了，很详细。
, X( x1 R# I+ T) K补充一点：关于脂肪干细胞鉴定，多向分化能力可以加以证明，目前主要有两种办法：1，体外诱导向成骨、成脂、成软骨等各个方向分化，通过染色观察其表达相应目标细胞蛋白，进而证明诱导分化能力。2，将干细胞复合支架材料植入裸鼠体内，可以成瘤，含有多种组织类型，也可以证明脂肪组织来源的细胞中含有多能细胞。

相宜

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今天才看到这么好的回复，受用了，谢谢