小鼠脂肪干细胞纯度问题~

yunxinxu

经过几个小时，本人基本浏览所有人的帖子，关于脂肪干细胞原代分离培养的方法基本都一样，只是个别出现了培养过程中细胞状态的差异，这些问题似乎都已经随着经验的提高一一解决了。可是，我还是想问个大家似乎没有提到的问题：
2 C* u: g/ e  b1.原代分离出来的贴壁细胞中，都包括什么细胞？干细胞到底含量多少？随着代数的增加，干细胞纯度有没有改变？改变有多少？有没有做过流式的数据？
( u9 @! z8 N$ J# J& c/ g0 _如果这些经验数值我们都不知道，叫它干细胞，有点牵强吧？至少纯度不够。
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2.是不是向别的特定细胞分化前，必须经过流式，尤其是要向功能细胞分化而且用到临床上，是不是细胞很纯以后才能诱导？
; L; q( s* M" z$ S; u3 E* e3 N+ z. R  当然，如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以。
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3、脂肪干细胞向特定细胞分化前，对其Marker又没有统一标准，大家该如何选择？
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  I( |' x0 D0 S  p, i
9 u' }8 D4 X# c2 Y/ A请有经验的研究员介绍一下吧，很疑惑也很期待！

anti

我查了下文献，从脂肪组织中原代分离出来的干细胞成分中含有成熟脂肪细胞，前脂肪细胞，成纤维细胞，血管平滑肌细胞，内皮细胞，固有的单核和巨噬细胞。还有研究表明还含有淋巴细胞。* v2 Q3 B. J' j3 B% |  G/ Z
具体的你可以参考：Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.   
' G( Q& m: c$ V0 k! |* ?Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.* O+ m- ~) o0 Y" `- F5 K
还有Adipose tissues as an ancestral immune organ: site-specific change in obesity.) |4 f8 t9 o/ M' C
文献 这几篇是网页形式的我没下下来，楼主自己去找的看吧。
" a1 I' u9 G6 s4 N. Z我开始做脂肪干细胞的时候也有同样的疑问，没有足够的纯度怎么能达到好的疗效呢。现在做干细胞美容的越来越多，虽然患者注射了细胞，但细胞的成分那些医疗机构自己都说不清楚，无非是坑害消费者。做科研就要像楼主一样有颗严谨的心啊~* Z0 P( U+ L" Z1 E  r/ i/ }

anti

置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

yunxinxu

谢谢以上两位研究员，希望经验更丰富的研究员给更多的支持！

meister

间充质干细胞纯化有几种模式。
" n' o8 i2 `0 B+ n9 x1. 传代培养  U! k; h. @9 Y# P' s" W" s6 k
2.流式分选
6 Q; p! P2 g# N9 e6 n7 @4 w9 q3.磁珠分选。5 G5 g( i9 t7 }: o7 R
常规分离方法得到的间充质干细胞纯度较低，经以上方法纯化后，可以使纯度达到90%以上。
5 q# ?& z) `3 ~  T- K7 N

都市青蛙

anti 发表于 2011-10-12 13:03 ! D" ^, Y+ B$ m( m2 E% J% m
置于marker 有文献说向脂肪细胞分化后CD105表达会降低。

0 G, {" _8 I! j
的确是传代后CD105表达降低了
; U! k9 I& A. A+ L& I7 y# O文献上有提到这点; F/ s- @# Z. ^$ s! K- T
我自己做的也发现这个问题了

namulow

ADSC尚未发现特异的marker, 因此目前并无法纯化为单一细胞系

zerollx

1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯长最终淹没干细胞，分离程序不完善，也会引入各种和更多的杂细胞。目前常规的培养体系中，原代贴壁细胞主要有内皮细胞（来自于血管，原代剔除血管和后期传代操作可去之）、造血干细胞（来自于血液，调整首次换液时间可去之）、脂肪细胞（洗涤不充分或洗涤方法错误引入，充分洗涤，洗液从表面吸弃，三次洗涤可去之）等；随着代数的增加，纯度是否有改变得看你的传代方法了，前三代传代最重要，得利用杂细胞与干细胞消化所需的时间上的差异来逐代纯化，三代以后纯度就相当高了。% f5 x" v8 k: p  e- d! `
2、是否必须过流式，你发文章时编辑可能会问你，若你没做可能不好解释；用于临床最好还是严格点，因为对于种子细胞的必须得有清晰的背景，而且用于临床的细胞，对其纯度要求是非常高的，这里的纯度不仅只种子细胞的纯度，还有诱导后目的细胞的纯度，没诱导成功的干细胞与诱导后的细胞混杂注入治疗，很可能致瘤，这也是ES细胞用于临床治疗的瓶颈所在，不过最近报道的PHA纯化可以很好的减弱这种影响。
1 J8 R) B. X' {" g7 Q7 S  对于你说的“如果只是为了向别的细胞分化来鉴定其多能性，本人认为不过流式也可以”，个人认为不合理，原代分离的脂肪干细胞中有很多的杂细胞，也可能有造血干细胞，你没有用流式鉴定细胞纯度，没有剔除杂细胞的影响，诱导后的细胞你能说一定就是由脂肪干细胞诱导而来的么？这就造成了一定的不严谨性。" _# C2 g! I+ t8 R5 o/ p

2 u1 m$ f. X8 q0 D4 {1 k' i: G) G6 e3、脂肪干细胞没有特定的Marker，一直是其鉴定的掣肘，所以目前的同一的鉴定方法是三个方面相互辅佐共鉴之，我想你也应该看到过相关的资料：即贴壁生长、强自我更新能力，间充质来源干细胞Maker高阳性表达，三系分化，这是目前算是最严谨的鉴定方法了。3 R$ R; M% n6 q2 n8 [% b# p0 d( i
   个人拙见，希望对你有帮助……; U6 M1 g% U  O1 k$ B+ K+ s2 o! w8 o' m
: H- Y( ?) A1 c; X' R4 {

namulow

zerollx 发表于 2011-11-13 00:31 5 c! B% k$ T! z, T- `  K
1、原代分离出贴壁细胞的种类，与你的培养体系和分离体系有着重要的关系，曾经尝试过ES培养基培养，杂细胞疯 ...

0 F6 D7 F& M5 q7 \+ y受教了，很详细。! |3 H  r; b. K: Q
补充一点：关于脂肪干细胞鉴定，多向分化能力可以加以证明，目前主要有两种办法：1，体外诱导向成骨、成脂、成软骨等各个方向分化，通过染色观察其表达相应目标细胞蛋白，进而证明诱导分化能力。2，将干细胞复合支架材料植入裸鼠体内，可以成瘤，含有多种组织类型，也可以证明脂肪组织来源的细胞中含有多能细胞。

相宜

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/ F. E8 j+ c2 R% V- w) j- q1 x) ]- ], A4 B. Q  g& Z) w9 _$ M
今天才看到这么好的回复，受用了，谢谢