大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

ying

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～
+ G: N& ?( `6 e7 P* A. u$ l转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。3 ]" D4 V4 G: D0 P% u) g

ying

回复 sj03572001 的帖子* p$ y* @: z" [& E* R* r
+ x4 ?& T. I4 x+ e) M. M
我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。
$ s5 C3 @! G$ _. a如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。$ s" e, n: G! R% U, }# M
祝顺利！

ying

回复 huangcong1988 的帖子# |0 k) `. O( M6 ~3 S5 {2 B: [8 z

$ ^+ R! O8 O9 O$ U& J1 [' S% y2 u浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

ying

回复 huangcong1988 的帖子
. L+ {: I+ H3 F) S4 c8 F, Y( t+ F
按这样说来，确实是被稀释了。
4 I, k1 a# x- c8 e& J* b不过，通常我是这样认为的:
) l& l7 F/ T) c( p  G, T一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，5 F2 F# ^' G" H: ~/ q
浓缩后，变成一个坨坨，* N% x, b# `  h, U7 m: |
把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，5 J6 k! K  `' C2 ^# h
假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

ying

回复 salomemao 的帖子- U7 \  Z6 {; ]) E0 W

. L1 q- s; M& N4 N# w/ Q; a& ^转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

ying

回复 salomemao 的帖子- w, @. l3 a2 `9 l! `

7 F1 G( r0 z: U2 }$ p是啊，让你见笑了 ：）

ying

回复 huangcong1988 的帖子0 T. i% Y/ @$ f& X& u# h; }- |2 A

3 Y, \' j% V4 l  y0 p9 m我是用50毫升离心管，PEG6000和浓NaCl来浓缩，低速离心。一次可以离35ml，最后溶在400微升里面，扣除损失，估计浓缩应该在80倍左右。我还用超速离心法浓缩过，那个方法得到的坨坨很少，因为坨坨主要是血清里的蛋白，超离的时候很少下来。超离我是37毫升最后可以溶在大概200微升甚至更少。

ying

回复 salomemao 的帖子8 r0 q5 H' Z4 ^8 H+ E6 K
( U; l4 G6 H  Z1 |: R/ f

ying

回复 huangcong1988 的帖子
; ^# M; T( y- Q9 C7 H$ E- A) Z) H# Q- g3 H& b
是的。