流式检测CD133细胞不分群的原因？

xyzxl

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# l! S# ]0 L+ z% s, G) a5 O$ x0 z流式检测细胞系表面CD133及B的双表达，结果如图，两个指标测出来感觉都是整体移动，第二天重复了一次，结果CD133表达率下降了，B也检测不到了。
0 k$ k: w3 F6 Y/ D" ^问题：6 e7 [1 |" {8 O* h
1 第一次做的结果能算阳性吗？两次结果不一致是不是要用阳性对照来排除抗体的原因？) \' r  a/ P6 X) H5 o* d
2 两个指标都不分群是细胞系本身的原因还是操作过程中的问题呢？要怎么排除？# `5 T7 B0 \6 m
3胰酶会不会对表面抗原有影响？细胞黏附性比较强不用胰酶消化的话用什么方法比较好？
1 x( ?# W- d8 o, `4因为要到别处检测，染完色后可能要1-3小时才能上机检测，会不会有影响？需不需要固定？
7 T0 k& t: T1 k0 B初次做流式，不知道从哪开始排除，还有别的原因吗？请各位大侠指点，小女子感激不尽8 i& u; ~% k' [4 e: c
操作如下：0 r9 E6 W" S5 k5 ?9 X0 z
洗液：含2%BSA的PBS（PH=7.2 今天配的）, d; Y9 F" K* U6 _; x
离心均为1800rpm*5min 9 D' |6 k7 d* X# c1 e
1.细胞胰酶消化，加培养基终止消化，离心，洗液洗2遍3 w1 G  Y; o: t2 X2 l
2.计数，稀释至终浓度1*10^6/100ul
, T/ O* H  |5 f: p3分组（1）空白组 （2）PE-A 单标 （3）APC-B单标 （4）双标 0 i5 Q7 J: Y$ F' e4 P! A+ v3 @
以下步骤均为避光下完成9 q! ^& y' m, N, H6 T$ L8 t6 a. ^
4一抗冰上避光孵育30min
& s8 o  G$ W$ p- n- d5 2ml洗液 离心 洗2次, o% k, p( _, }
6 400ul洗液重悬上机检测3 k/ r- L5 I4 h  l4 Q/ a$ l1 ?

2011-10-20 23:36 上传

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( ]3 P" p) P. D  _0 L# ~& `

2011-10-20 23:58 上传

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chutu

PE和APC这两种染料的激发光波峰之间没有重叠，所以没有调补偿的问题。楼上的朋友说得对，胰酶消化对有的膜表面蛋白有较大影响，如果确实存在这个问题应该改用其它消化解离方法。流式检测细胞不分群而是整体偏移，可能因为抗原表达弱，而且细胞之间的表达差异还很大才会出现，否则都是假阳性。从你的结果看确实不好断定。可以选用更合适的封闭液处理以及多做isotype对照、阳性对照来确定。

xyzxl

回复 fish_zbw1985 的帖子3 T& U: K7 q! g+ U0 _( K0 `+ _
4 V( h% V4 p, ^, H
哦，一起等高手解答

fish_zbw1985

我做流式也遇到了这样的问题，同问关于前处理的方法

xyzxl

zerollx 发表于 2011-10-21 09:27 . T+ ?3 I4 ~) H
1、流式检测有就有，没有就没有，阴性阳性没有绝对的标准，很多时候只是说比例大于某个值才属阳，小于某个值 ...

6 {& w3 I2 W" ~- T* m请问前处理是指那些呢？我的这个是练手，所以细胞系消化后直接做，没做干预，也想看看未作处理时的双表达情况，我的步骤中还有什么需要改进的地方吗？
, L* [. Z' \/ [3 ~" I2 现在没有gibco的tryple express，还有其他的办法吗？比如说刮？
- N6 G& U$ Z& T3

Tonypan

CD133在你的HT29上是弱表达的抗原，不分群的。如果想阳性部分明显一点的话可以选择荧光增强剂。
4 W8 f* _- {/ W, ~% c) p4 }6 ~; }对照建议做IgG2b-PE的一个同型对照，消除下本底。" N% c) V1 H- t
补偿建议用淋巴细胞染CD3,CD4这样的去调节补偿，或者用Beads做补偿。若表达的抗原不分群补偿是否合适是很难确定的。3 Z" e4 l7 ?8 Q* B

5 a  z. F# B: w- D6 i, ]& g0 r至于B是什么东西就不清楚了。应该也是弱表达抗原。1 ~( Z& a& t2 `) f
6 o" f  k# W8 |, T
祝你好运啦！0 ^; I. W' C  O1 y/ J, C# X

xyzxl

" _; t) `1 |7 F

zerollx 发表于 2011-10-21 09:27
8 ^# N3 T! L3 L0 s5 c5 E1、流式检测有就有，没有就没有，阴性阳性没有绝对的标准，很多时候只是说比例大于某个值才属阳，小于某个值 ...

2 r+ j  _  q7 e' f+ T6 O
0 m- ?+ p9 }. `5 B. u' e; k  V
[非常感谢版主！9 q  u- n! Y% k3 @: _1 V) V% ]
第一个问题我是想知道图中出现在Q2或Q4象限的细胞是特异性结合还是由于没漂洗彻底或者其他非特异性的结合，即这种情况是不是资料中说的细胞群整体45°角平移？文献中一般CD133染色都是分群很明显的，不过在我做的细胞系中也有分群不明显的，我做的结果该怎么判断呢（见图）# n# w9 C: i, y- D: E1 r: G

2011-10-21 11:34 上传

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xyzxl

回复 aminhair 的帖子
8 _3 g2 a* F% U! O8 v; S2 p- o" C) K) B8 \1 y
非常感谢！
+ u2 f% D# Z( C2 X0 ]+ u参数、补偿都是同一个老师设的，应该没有改% U. A+ @+ g2 l3 I5 p
第一次做了单标调补偿，后来老师说APC和PE可以不次次调补偿，第二次没有设单标! E6 d  i) D; A2 P- Q7 p8 S8 I
还有请问镜检怎么做呢？是取一部分最后的悬浮液滴到玻片上吗？问题比较白痴，没做过

aminhair

建议先镜检，确定确实有荧光。
( c0 L/ \) _& B( K% e* N% h你第二次做的峰形态不如第一次做的。有可能有些参数你改动了。9 ]% D2 o( X7 A, p* o! r
第一次做的可以再补偿一下，达到更优的结果。

zerollx

$ x' J) n' h. W( N+ ~: l5 Y( W1 E/ ^3 ]% [! G& K2 X1 Q# l; ?& i
1、流式检测有就有，没有就没有，阴性阳性没有绝对的标准，很多时候只是说比例大于某个值才属阳，小于某个值才属阴，所以得看你这个指标通用的标准是什么。有阳性对照当然更好，但是你得保证你用阳性抗体来做的时候前处理没问题，否则你的前处理也是一个变量。5 S1 @; p1 P, @$ c% |3 ?
2、细胞分不开的因素有个人认为有以下因素： / {* S6 k9 r2 h% t" A0 M" {! U
   （1）抗体的特异性不好
" O6 b1 }, Y8 m! u! ~    （2）选的单标不合适，若细胞本身抗原就低表达，若还选择弱荧光的FITC那估计确实难以分开。4 }0 r8 N% N  [( ~; i6 \
     （3）、前处理有问题，这点我自己感触很深，因为我刚做流式的时候单标抗体也分不开，后来经过好几次摸索才将细胞分开的，细胞一样，抗体也一样，就是前处理不一样。
# V" F' {' A2 m3 |; Y- c- ^% Y    （4）、仪器参数的设置，这个一般操作人员的技术比较高应该不会有多大问题，不过我们一般做的时候都会加一个同型对照来消除非特异性结合，除非你能确定你的抗体特异性非常有保障，否则还是建议你加个同型对照。# e# Q" `4 f: y

4 `7 O* `% i& g4 l( l      但我觉得最主要的还是你的前处理。, x' R& _- s4 Z4 @
3.胰酶消化有影响，非常有影响，因为你的抗原是膜抗原，胰酶会对其造成一定的损伤，但是损伤的程度就具体抗原具体对待了。我用Gibco 的Tryple Express，它是一种植物源性的蛋白酶，很温和，用它消化效果会很好。- J) c+ G4 L7 h" [/ V3 r- A
4、要固定，洗完后用1%的多聚甲醛4度至少避光固定30min以上，若暂时不用，4度放2周都没问题的。B的差异这么大，若材料都一样，设门也没什么问题那肯定就是你样品处理的问题了，最好每次做3个平行，好有个参考。多摸索几次，祝你成功。