贡献详细磷酸钙转染法试剂配制过程

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酸钙转染法& J6 H, E3 p2 W3 W" @4 g% v
材料：: O3 n9 i4 s9 h  ^0 G. H( ^
质粒DNA
' H  {- M2 X- B' x( t指数生长的真核细胞
! g8 W4 A" R8 F! D3 K. J( q# j/ J! n2 M CaCl27 _" a1 i' J+ f) g# A! j
2×HBS （pH 7.05）1 p8 _, y# M1 R5 e! n% l* _
配方:
9 n, j. F; C1 ^0 K# D. ~& X& t7 v2×HBS (pH7.05)：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g和 HEPES 10 g，调pH至7.05，定容至1 升，过滤（0.2μm 滤膜）后储存于4℃备用。( Z& i) m$ d) a& j) f0 z
方法：! M3 y# Q# ?& m9 W2 s
1. 细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 1×105至 4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的 40~70％） 。将细胞置于含 5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。 转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基） 。$ G9 X- j. G5 x& G1 `2 I  e: @1 C
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。: x7 P# m7 c! {5 K/ j; {
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积 2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。" g4 r: P$ m; ^% o
注： 可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色， 应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。5 P$ x) ~$ x' y
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其中的关键是HBS的PH值，有人说6.8-6.9也行。
$ @- ?2 L/ R5 q1 O以上方法供大家参考。

细胞海洋

注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，
! v$ f5 W$ K" Z; r4 }避免形成过大的颗粒，影响转染效率。+ }& d( L/ D. H, R* a, m2 B1 |
3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％ CO2 的37℃温箱孵育。8 h# e) l& t/ W1 R. u2 ~) v9 u
后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放
) c, y/ s- P5 `置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。- p1 ^, o$ a6 {
参考：分子克隆实验指南第三版（p1284～1285）
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