贡献详细磷酸钙转染法试剂配制过程

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酸钙转染法7 z0 w1 ]2 `4 f) r
材料：
7 K/ Z" O9 n  P: i! T' W质粒DNA0 I+ c  U0 I4 O+ l# N8 E( b
指数生长的真核细胞5 J7 H1 c$ A0 _. z/ Z, H5 `+ j4 F
2 M CaCl2
4 s! T! U, v  C, F2×HBS （pH 7.05）( z' H$ L8 I2 a: g5 y
配方:
* B5 V+ W2 }; v7 y4 e2×HBS (pH7.05)：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g和 HEPES 10 g，调pH至7.05，定容至1 升，过滤（0.2μm 滤膜）后储存于4℃备用。
! p" z% f! n3 t3 c方法：4 x0 k- c' m3 H( l! T
1. 细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 1×105至 4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的 40~70％） 。将细胞置于含 5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。 转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基） 。) f) p8 w6 m+ c( e4 F, r
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。6 L7 I( C( D, b
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积 2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
+ g, e8 G1 {" F8 f& w' x5 i注： 可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色， 应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。  l5 ]- T' n# C2 [' M( {

2 H. W. r" {, B; Z* [/ U7 r其中的关键是HBS的PH值，有人说6.8-6.9也行。! t( J) v0 p- [/ a3 w
以上方法供大家参考。

细胞海洋

注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，" g' E! @2 `3 W4 ^
避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
" i  r4 e# l; w6 u$ U$ E7 s8 ^3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％ CO2 的37℃温箱孵育。8 h. s8 q/ v( Y2 y
后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放
4 _8 b* ^7 Y5 x; J& t  Y6 n2 ]置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。2 M8 H& F7 W& d$ M% q; B
参考：分子克隆实验指南第三版（p1284～1285）
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