求教 单细胞克隆

shuicaoxi

请大家不要笑我的问题笨。我需要需找干细胞，可以用鉴定干细胞的“ in vitro clonal assay”来做吗？这个也就是 有限细胞稀释法 的单细胞克隆技术对吗？ 但是我 不很明白，这个实验的原理到底是什么，为什么单细胞克隆可以鉴定干细胞呢，普通细胞在EFG的培养下不是也可以分裂增殖吗？而干细胞也只是培养几代，怎么就可以和普通细胞鉴别呢。相关文献读的不够，这个实验原理就是不明白，恳请大家指导一下，万分感谢！

流浪的波斯猫

不大明白你所说的要寻找干细胞是什么意思， 干细胞的基本定义是自我更新，自我增殖以及多向分化潜能，你所说的体外成克隆分析是用来检测干细胞的干性的一种方法，前提是已经确定该细胞是干细胞，但是能不能发过来用自己也不是很清楚，
! d  {6 [$ C' L" G有限细胞稀释法是单细胞克隆的一种方法，我的理解是平时我们使用的细胞，尤其是在基础医学研究中所使用的干细胞，都是一群异质细胞群体，这个混合的细胞集合体可能在某一细胞形态上表现出绝对优势，但是可能的分子机制是有很大差别的，但是通过有限细胞稀释法而获得的通过单个细胞形成的克隆群体能够在很大程度上表现出同质，这样可以保证细胞的稳定性，尤其是在工业生产的筛选过程中，单克隆的筛选可能更为严格与重要。
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流浪的波斯猫

其实体内真正的干细胞一般是出于相对静止期的，就是有自我增殖和更新饿能力，但是这种能力一般是被抑制的，只有在需要的时候才会表现出来& ~1 {5 a/ `5 H, e- j$ P

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shuicaoxi

回复 流浪的波斯猫 的帖子2 ^* ]3 ~4 V. _' I& {) c
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非常感谢你哦！我的课题是试图在未报道有干细胞的组织内寻找它存在干细胞的证据。我读的文献，寻找干细胞时，是拿该细胞单细胞克隆法作为一个证据的，可能是我理解不到位，我描述下它的实验步骤哈：把组织细胞分离，单独培养在EFG中，两天后部分细胞存活，长成sphere colony，取sphere colony 内部的细胞鉴定，仍有未分化标志；再分离消化sphere colony 内部细胞，单细胞培养，大部分细胞仍可以形成sphere colony，内部的细胞仍有未分化特性，因而认定，最初培养的细胞是干细胞。 这个方法算是 单细胞克隆 吗？这个方法的原理是什么呢，是细胞在体外增殖，并仍能保持原有性质，因而认定是干细胞吗？但是这个增殖的次数不是太少了吗，足以证明干细胞的无限增殖能力吗？普通非干细胞在EFG等条件下培养，是什么情况呢？ 写的很多，不知道这次是否描述清楚，麻烦你了。

shuicaoxi

没人理我

idealgas

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% x# a) n2 y$ f* i2 b我觉得你说的这个步骤只能说明最初培养的细胞在传代过程中能够保持干性，但是想要说明其能够无限制增殖能力，只能是做很长时间的传代才行，我记得像是哺乳动物细胞建系，或者永生化的话，需要传20代以上，鸟类需要30-40代以上，乌龟一类的需要60代以上才能说明已经建立了永生化的细胞系，同时在传代的时候需要定期做核型的分析，建立细胞系，第一个看的就是核型如何，其他的特征都还在后面的鉴定中。

流浪的波斯猫

回复 shuicaoxi 的帖子" [5 X) b, d- M! d$ @4 c& D' p

. \- U$ c9 S4 p5 I/ e前几天忙了哇 呵呵 6 C( D1 ]2 n6 m  E$ Q  o8 r+ E
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首先，不知道你取材的部位，基本上成体组织内的干细胞存在比例很小，并且大部分存在于体内特殊的部位，不会很简单的被人分离得到，有些部位的细胞不是干细胞也会表现出很强的增殖能力，如果单细胞悬液接种的密度不是很大，很容易形成你所说的sphere colony，细胞只有在适合的密度下才更趋向于迁移分散而表现出分布均匀，但是密度过低则细胞会表现出所谓的抱团现象，我们在镜下看到的就是一个克隆球；
- `5 J4 i9 N. i7 g, f还有，你选择的未分化标记是否具有特异性，. l" \4 L; D* J2 J1 z
普通的干细胞在培养基中加入EGF是为了保持干细胞的特性，防止其自分化。

shuicaoxi

回复 idealgas 的帖子5 v+ R( T: l, f: i& d& Y
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先谢谢你哦！嗯，我现在也逐渐想明白了点，这样传代培养只能保证细胞纯化，而传代次数太少，无法说明有无限的增殖能力。所以我觉得这个方法不适用，还是用BrdU滞留细胞标记，以及构建损伤模型观察增生吧。可否再请教你，BrdU的用量,标记时间和跟踪观察时间是多少呢？查到的文献，说法不一，单位不一，有10ml/kg, 20mg/kg,100mg/kg.  相关文献读的不够，很多问题都不懂，唉。

shuicaoxi

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8 ~* t; Y) C* q+ ~8 ~8 H嘿，谢谢你又来了哈！我想做晶状体上皮，如你所说，这个sphere colony 并不足以证明干细胞的增殖能力，而且晶状体上皮细胞本身的原代培养很不容易，所以我还是放弃这个想法吧。我计划用BrdU标记寻找滞留细胞是比较常规的方法吧，这个做出来的概率会高很多吧。再加上些辅助的端粒长度，端粒酶活性，损伤刺激下的细胞增殖能力，这些，足以证明干细胞的存在性吗？因为快开题了，实验还未设计完整，有很多困惑，很多问题，麻烦你了！多谢大家的热心帮助。

流浪的波斯猫

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9 V  `# {, J& H1 z$ c: N我知道的也很有限的呵呵 具体你可以和你老板咨询一下的哇
- @+ W/ q+ R; Q但是 BrdU标记体内寻找干细胞是可以的，也有文章这么做过，但是这个难度很大，时间很长，大约一年吧，用到的技术很多，并且都是体内和体外相结合运用的，只是在文章上看到，估计以前没做过考这个硕士毕业肯定是要延期的 呵呵
# s! k+ F3 H- ~" q还有端粒的长度和端粒酶的活性主要是与细胞是否老化有关，能不能证明干细胞这个真不大清楚