细胞流式检测准备（直接标记一抗）

kgx1986

试剂准备. a& {$ U2 B# D  X1 O' h
1.准备荧光标记的一抗和同型对照抗体
/ V: s* i% M: A2.细胞洗液：含有2%BSA（牛血清白蛋白）、0.1%叠丹化钠的PBS.
6 t5 Y' j: t) v- W8 u3.固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）pH值一定要准确，否则会影响检测结果。
" ~+ f( L1 u" F7 M1 j. n. q* Y! C操作方法. Q  d* F9 c4 J! S2 f
1. 每个样品取2支流式检测管，分别注明同型对照和待测，两管分别加入106-7/100μl个待侧细胞（若细胞浓度低或加入的细胞悬液较多，可1200转/每分钟，10分钟低温离心，弃上清，保证100μl被检样品）# N$ w; I* `6 ~
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。8 w+ `9 E% m* o% \/ [: V
3. 4℃度孵育30分钟，加入细胞洗液，1200转/每分钟，10分钟低温离心，反复2次。% j/ H3 D$ H# S& e3 `
4. 去除上清，控干，加入固定液0.5ml,混匀。
1 _: I. p- c7 r/ W0 O+ D1 Z5. 上机检测，先做同型对照，调整电压至阴性区范围，再测实验管即可。

mzyysmile

2. 我买的是100μg的规格包装，里面是干粉，可以溶解为2mg∕ml的溶液50μl，我想问的是：一抗的选择梯度1：20、50、100倍稀释是指50μl可以稀释为1000μl、2500μl、5000μl吗？使用时所加的30μl 是稀释后的抗体吗" J5 T7 q0 v, {0 c( R# S$ Z
; f" t4 r' n* T) s
抗体的浓度1：20 是指你有200 ul的细胞悬液，加10 ul的抗体。* P2 e/ F6 O3 H9 t
细胞悬液的浓度，我们选择的一般是1 million cells/ ml，甚至会更高，不过在做Flow analysis的时候，或降低细胞悬液的浓度的。" V/ H) L" b( u# @, ^
其实抗体的浓度是针对细胞的数目相对而言的，说明书上一般会写1 million cells加。。。ul的抗体。
; L! E' [% m% [& [: Z所以，细胞悬液和抗体的浓度都是要你自己摸索的。

翅膀111

我记的抗体说明书上是写1ug可以和10的6次方个细胞反应，所以我一般按此比例加抗体。

kgx1986

6 Z& \  Y* A( q' Y6 w( Y9 {
9 o! S2 D: c. H
回复 mzyysmile 的帖子) z' X) `# k) i; i

/ v/ L0 t5 z/ @! y; }谢谢老师对我疑问的解答。, B# @/ Q. \* `. v4 Q) z
对于第二个问题我想知道你的看法。没做过流式，渴望你对于我这个“问题少女”的傻问题能够耐心解答 。
, i* l" R; Q9 e% H, R: H是不是100μl待检细胞内加入30μl稀释后的抗体（即50μl抗体按照1：50稀释得到2500μl稀释后的抗体）？还是待检的样品有1500μl按照抗体：样本=1：50需要加入抗体30μl？你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

mzyysmile

对于你的第一个问题，不推荐用no labeling 做negative control' C9 k( U7 b. R; I9 y
相同voltage下，用No labeling做gating位置明显比用Isotype control做gating的位置靠前很多。。。。所以用No labeling的话，得出的positive Cell percentage比实际的要多很多。。。

kgx1986

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3 t# N+ B3 @, i7 V" T$ q
( Z1 G* V; Y# F9 k& T, ]谢谢老师，我的理解错了。我之前没做过流式，一直以为的是：每个流式管里的细胞容积是100μl，这100μl里面含有细胞量是10（6-7次方），也就是说细胞浓度是10（7-8次方）∕ml。
! t1 e0 Y4 B; w9 o( m) I% y我想问下你做流式的时候流式管里的细胞容积一般加多少比较合适？细胞浓度一般选择多少？

zxcv12345

30μl是他的抗体的稀释倍数所需的抗体。你的要按你的抗体使用说明书稀释。如果需优化，做选择几个梯度

kgx1986

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$ l0 X2 {) e! F' u; q5 N) w( \& n; Q: F$ v6 Y1 J. a# Z
2. 同型对照管中加入荧光标记同型对照抗体，做阴性对照；待测管中加入荧光标记的一抗，做为实验管，各加30μl (按抗体使用说明书，一抗可做选择几个梯度1：20、50、100倍稀释)混匀即可。6 J. Q$ D' z9 H; @9 i! a* t- Y
: p' M$ `. B  R
这一条中我的理解是：试验管和对照管内有细胞100μl ，50μl 的抗体按照一定比例稀释后，各取30μl加入试验管和对照管混匀，然后接下一步。
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我觉得你的理解是，抗体不稀释，如果取一定容积的细胞的话，那么所需抗体容积是细胞容积的1∕20,1∕50,1∕100。操作说明中的“30μl”就没什么作用了。

kgx1986

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' Z9 h/ s; \0 k7 x! y( q
( {# L& |# D& n9 u感谢呀，感谢

zxcv12345

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0 {( d% T' d0 {2 C% R. O5 K1 n1 p* W. |
问题1：可以
# M, p2 [4 B1 _! v( i7 l0 o5 {* r问题2：算法没错，但50ul是储存液，不能全部直接稀释，不利于保存。比如你的用FACS的细胞是在1ml，你要1：100稀释，加入10ul进入1ml细胞混匀