干细胞分选效率低，提的RNA浓度过低，什么原因？？？

学习！学习！

        我们用的是天津澋洋生物的小鼠淋巴分离液，美天旎的lin-和CD117免疫磁珠。先用淋巴分离液分选单个核细胞，再过lin-和CD117磁珠分选。分选后的细胞量还是很大的，8只8w龄的小鼠可以得到7×10的6次方个细胞，但是镜下观察有很多红细胞，培养一天，第二天看时竟有很多梭形的贴壁细胞。但即使这样，细胞量还是可以的，种六孔板，每孔有2×10的6次方个细胞，TRIzol提RNA，过程中也能看到RNA沉淀，但测RNA浓度却是很低，无法继续后面的实验，纯度还可以。我觉得主要问题还在淋巴分离的那步，我们是2000转离心20分钟，之前试过1500转15分，1500转20分，但白膜层还不是很漂亮。这实验中应该问题很多，我们也总结了一下，请大家给看看，指点一下。谢谢！

wangzhiqi86

我们用的是3000rpm离心30min，而且注意在离心开始和结束的时候，转速一定要尽可能的保持慢速下降程序，这个对密度梯度离心很重要，不然本来已经分层的细胞层很容易因为急速下降而混在一起了。

zhusealin

用转速不太准，我们分离人的淋巴细胞用的是600g  20min,  离心机的刹车要去掉，温度20度

zxcv12345

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2×10的6次方个细胞的细胞可以的。
2 N! g5 E% x" ORNA过少和淋巴分离无关，提 RNA，离心后，应注意RNA沉淀容易丢失

yglky

  d  g& s; m4 y. B% M$ P
! d. P' m6 G7 [$ n: W3 @提取RNA的细胞量在10的4次以上就足够了，抽提结束后RNA沉淀用12ul左右DEPC-H2O溶解，取1-2ul测定浓度值，剩下的全部用于RT，就能够避免提取RNA浓度太低等问题。
: C' }& X% R1 ^; g5 C+ a7 j还有，离心参数一定要按照离心力（g）来计算，除非是使用同一型号转子，否则rpm和g之间差别很大。

fananran2003

个人感觉，能看见RNA沉淀，密度不应该太低，跟你细胞的分离没什么关系，是不是你晾干的过程给RNA吹跑掉了啊，

xiaoyurly

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$ L  ~9 T" L6 d
我们密度梯度离心用2000rpm 30min，注意要慢降，否则密度梯度会被破坏。10^6数量级的细胞不可能提不出RNA来的，不知是否trizol裂解不充分，或者过期失效了？？？trizol保质期好像不是很长。但是一般能看到沉淀RNA的量就比较可观，是否溶解不充分？？溶解RNA可以水浴加热助溶。