请教一下关于肿瘤干细胞培养的问题，如何挑出干细胞球？

暮色英雄

我培养的一盘胶质瘤干细胞里面有很多死细胞，同时还存在着干细胞球，我想单独挑出干细胞球来培养，请问怎么才能挑出来呢？是用多大的枪，是不是需要在显微镜下面操作，如何保持无菌环境？谢谢了

genedu

我的建议：根据我个人经验来讲
" o0 X- e7 [4 q* |1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液" }9 P8 r) M4 S) y. |1 R
2.如果干细胞球比较小的话，可以现在细胞培养板子地下，用marker笔标记一下，如果比较大，肉眼可见，就不必
. w/ U7 B3 }3 N1 A+ u) [& l5 s3.挑取的时候是用显微镜，显微镜先用酒精擦拭，放进工作台后再紫外灭菌，假如需要长时间操作的话，显微镜最好别往外拿3 _% D& [7 s7 s4 _& g/ T
4.准备好96孔板，其中放入适量（参考50ul）胰酶或其他酶准备消化用。准备24孔板，是消化后用来培养细胞的。  ^7 Z' U/ f: ~& W# t! w
5.用20ul的枪从细胞培养板中进行挑取，放入96孔板。消化一定时间后（参考5miin)，转入24孔板。
9 N8 T. o& B; i: T- y  q  P  j$ D1 V

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 13:42
) |4 z* P: ?; l我的建议：根据我个人经验来讲/ ~. _! j2 ~+ t; S9 t7 s
1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液8 t: w! ?- r7 J  F" w  |+ j
2.如果干细胞球比较小的 ...

  a: l' _3 W- t5 k' C1 r干细胞球在显微镜下面看着都比较小，肉眼能看清楚吗？
3 C0 o8 l4 j$ V' g另外为什么要用96孔板呢，挑出来的干细胞不能直接放到6孔板培养吗？而且我没有加血清的，还有必要用胰酶来消化吗？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子
6 y9 b# ~% G. B, T+ t
4 t& l6 L/ S& i9 y我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞球的话，时间比较长之后，他会长到肉眼可见。
' W  K- U# [. j' m6 ^一般来说，消化之后细胞变得比较散，这样更加利于他的传代培养，还有消化的时候，并不是一定得用胰酶，胰酶只是最普通的消化酶，比如在大鼠的ES上，用胰酶效果就不是很好。

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 14:06
, I. i+ d4 Z  F* T+ J回复 暮色英雄 的帖子$ Y, W  `* d! S. o( n
( i( k+ f) f5 \( T+ ^% n/ c  D
我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞 ...

+ [, w3 o6 k6 Y; {
嗯，还有一个问题，单独将干细胞球挑出来养是放在越小的孔里面养越好吗，比如用96孔板？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子' V" J/ n! U; W' @' B

/ t. A$ o/ t  t4 Q9 ^1 a一般96孔板是用来消化的，细胞量比较少的时候24孔板就行，真正培养细胞的话96孔板忒小

小木梅

回复 genedu 的帖子
+ F6 U; [! [5 u$ j1 k6 r. B, A# ?- M+ i  Q( r% F) y
我想请问一下  是不是一个96孔只挑一个球进去消化？在96孔里消化后直接移到24孔板里培养吗？这中间需不需要除去消化酶这一步骤？如何除去消化酶（50ul很少无法离心吧）？

genedu

回复 小木梅 的帖子- A, g4 @# @* u4 E; m$ O6 c! N. k
+ L8 B7 a3 w9 N. |, W5 Z) f
96孔板是只消化一个球，消化后直接移到24孔板，如果24孔板里面有血清就不需要去消化酶，如果没有的话，就先加2倍（100ul)中和，然后再放入24孔板

小木梅

回复 genedu 的帖子
" B/ l% ^+ T/ c$ p. `* F) e2 I8 d" M6 }) T
谢谢，我用的是无血清培养基，中和就可以了是吧？24孔板一般加多少培养液呢？种下去后多久换液？一般挑细胞球是原代培养或者细胞系第一次成球的时候才做吗？另外请教一下，挑出来的细胞球有没有必要做标记，比如球一号，球二号……以及其各球后代要不要区分开来？

genedu

回复 小木梅 的帖子. ^! i1 v) T! K/ `. g: I/ v6 G

+ R3 \* u8 l4 `, U: X无血清的就先在96孔板中和先，24孔板加1ml，第一次最好是24h换液，因为是有血清的；第一次成球就可以做，如果效果好的话；挑出来的球看你要干什么了；一般是看24孔板中那个球长得好，确定自己要用它来做下游实验的，才标记