请教一下关于肿瘤干细胞培养的问题，如何挑出干细胞球？

暮色英雄

我培养的一盘胶质瘤干细胞里面有很多死细胞，同时还存在着干细胞球，我想单独挑出干细胞球来培养，请问怎么才能挑出来呢？是用多大的枪，是不是需要在显微镜下面操作，如何保持无菌环境？谢谢了

genedu

我的建议：根据我个人经验来讲6 J* i5 \5 h! K- |
1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液
- S7 {8 Y7 b* P) Y7 ?2.如果干细胞球比较小的话，可以现在细胞培养板子地下，用marker笔标记一下，如果比较大，肉眼可见，就不必
# Y+ z7 _% c6 \5 }3.挑取的时候是用显微镜，显微镜先用酒精擦拭，放进工作台后再紫外灭菌，假如需要长时间操作的话，显微镜最好别往外拿- Z3 k& g# i9 C/ T- w4 Y
4.准备好96孔板，其中放入适量（参考50ul）胰酶或其他酶准备消化用。准备24孔板，是消化后用来培养细胞的。
4 W+ R; p& t& Y2 Y/ U( X* u' U5.用20ul的枪从细胞培养板中进行挑取，放入96孔板。消化一定时间后（参考5miin)，转入24孔板。
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暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 13:42 / a. r  N7 D8 I; {" v9 O1 W+ k6 Z
我的建议：根据我个人经验来讲
' W) W2 k2 I" Z, }% t( F1.如果有很多死细胞的话，可以挑取之前先换一下液
/ r1 s9 U2 p/ T) R2.如果干细胞球比较小的 ...

, ?( s4 U+ U' R& Q
干细胞球在显微镜下面看着都比较小，肉眼能看清楚吗？
5 q' s. l% z! \) I4 }7 q: \  e1 j/ R; L另外为什么要用96孔板呢，挑出来的干细胞不能直接放到6孔板培养吗？而且我没有加血清的，还有必要用胰酶来消化吗？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子& C3 o+ P& H/ i5 x" ]/ J

7 }6 c+ T" {* o. u我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞球的话，时间比较长之后，他会长到肉眼可见。# i  R# I/ x- }$ C- q0 e# |7 B# }
一般来说，消化之后细胞变得比较散，这样更加利于他的传代培养，还有消化的时候，并不是一定得用胰酶，胰酶只是最普通的消化酶，比如在大鼠的ES上，用胰酶效果就不是很好。

暮色英雄

genedu 发表于 2011-11-16 14:06 $ E/ j" D$ ^6 B  K- i' b: R
回复 暮色英雄 的帖子8 N  h" B% ]8 m; k3 E' K
5 u2 ]1 i8 \- M% L9 a
我说的标记也是在显微镜(NIKON)下标记好的，然后再在显微镜下进行挑取。如果是干细胞 ...

' }$ W  ^+ C/ }! h. q+ s嗯，还有一个问题，单独将干细胞球挑出来养是放在越小的孔里面养越好吗，比如用96孔板？

genedu

回复 暮色英雄 的帖子; X, N( {1 U4 N: p: m- y. q
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一般96孔板是用来消化的，细胞量比较少的时候24孔板就行，真正培养细胞的话96孔板忒小

小木梅

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& D% M6 e3 I8 S
) K, P- q! M# `3 E  \我想请问一下  是不是一个96孔只挑一个球进去消化？在96孔里消化后直接移到24孔板里培养吗？这中间需不需要除去消化酶这一步骤？如何除去消化酶（50ul很少无法离心吧）？

genedu

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96孔板是只消化一个球，消化后直接移到24孔板，如果24孔板里面有血清就不需要去消化酶，如果没有的话，就先加2倍（100ul)中和，然后再放入24孔板

小木梅

回复 genedu 的帖子  A) [& G( o7 l+ B' v) u5 S$ y

' B/ m, {" x- ]' o谢谢，我用的是无血清培养基，中和就可以了是吧？24孔板一般加多少培养液呢？种下去后多久换液？一般挑细胞球是原代培养或者细胞系第一次成球的时候才做吗？另外请教一下，挑出来的细胞球有没有必要做标记，比如球一号，球二号……以及其各球后代要不要区分开来？

genedu

回复 小木梅 的帖子0 w3 M2 b- x# {3 {- c( ^$ `

& T3 g2 x  X2 w" O( H6 m/ d! H无血清的就先在96孔板中和先，24孔板加1ml，第一次最好是24h换液，因为是有血清的；第一次成球就可以做，如果效果好的话；挑出来的球看你要干什么了；一般是看24孔板中那个球长得好，确定自己要用它来做下游实验的，才标记