关于组织切片中GFP的检测

phdyhm

含有GFP标记的组织冰冻切片后，在荧光镜下可以看见有明显的发绿光荧光的细胞，通过福尔马林固定，再做免疫荧光，绿色荧光细胞就基本找不到了，请高手分析下原因，下一步应该怎么做？

namulow

请问：骨组织切片的话，如何才能更好的检测GFP? 冰冻切片还是石蜡切片？是不是比软组织切片更难一些？

zxcv12345

回复 phdyhm 的帖子/ o# ?2 G: F  T6 I0 ~

" R% b% @% [% g. q  w- j' m+ n% P我用甲醛固定细胞系，GFP没有问题。没做过冰冻切片。你可能的原因是可能固定时间过长。减少固定时间看看，做个时间梯度，看看在那个时间段GFP信号丢失。
4 m! S; s) d+ P. W1 Y8 K  I) z荧光镜下可看到银光，应不是蛋白降解
: @0 V9 @5 P5 `2 {乙醇、丙酮不能固定GFP表达蛋白。

goodboy

GFP蛋白荧光是要在其非变性时才能显现出来的，经过甲醛变形之后肯定不会有荧光。所以你应该做石蜡切片

dianying

回复 phdyhm 的帖子6 L/ a* y( T; h
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Try 10x Citrate Buffer pH 6.0

yinjiqingqq

回复 phdyhm 的帖子
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我以前做冰冻切片检测荧光时，也出现类似情况，不过我是用丙酮固定的，你可以换成乙醇试一下。如果不行，就做石蜡切片吧，用抗原修复后，效果还不错。

ilovelife

楼主的意思是想测内源性的GFP表达（分子克隆手段引入的GFP），不同于抗体铰链的GFP检测吧。楼主可以不用福尔马林处理，直接用DAPI染细胞，然后在荧光显微镜下和光镜下分别拍照即可。

qwmwolf

下一步，你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达，做好阳性对照，也有可能是抗体的原因，现在抗体出问题的几率也不小。

qwmwolf

下一步，你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达，做好阳性对照，也有可能是抗体的原因，现在抗体出问题的几率也不小。

qwmwolf

1、蛋白可能降解。理论上蛋白在取材两小时后就有不同程度的降解了。
1 X: U% M' f+ M, R/ G: a9 F2、其他的某些物质在操作过程中如果渗入组织中也可能产生干扰。先前有检测皮肤组织中绿色荧光，发现苦味酸也能在检测到绿色荧光。