关于组织切片中GFP的检测

phdyhm

含有GFP标记的组织冰冻切片后，在荧光镜下可以看见有明显的发绿光荧光的细胞，通过福尔马林固定，再做免疫荧光，绿色荧光细胞就基本找不到了，请高手分析下原因，下一步应该怎么做？

jhu132llh

福尔马林主要成分是甲醛
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jhu132llh

福尔马林主要成分是甲醛, x' Q+ c% m% }! @8 m. Y
规定那个是会发生蛋白交联从而荧光淬灭
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langziforever

嗯，同意楼上所说！福尔马林固定后应该是看不到GFP的自发荧光了的！你可以用免疫组化比如anti-GFP来看GFP的分布吧！

phdyhm

福尔马林固定只是一个处理步骤，最后肯定是要使用抗体的。我说的是加了anti-GFP以后出现的情况。

qwmwolf

1、蛋白可能降解。理论上蛋白在取材两小时后就有不同程度的降解了。
! v7 `2 a8 B0 s+ @4 S2、其他的某些物质在操作过程中如果渗入组织中也可能产生干扰。先前有检测皮肤组织中绿色荧光，发现苦味酸也能在检测到绿色荧光。

qwmwolf

下一步，你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达，做好阳性对照，也有可能是抗体的原因，现在抗体出问题的几率也不小。

qwmwolf

下一步，你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达，做好阳性对照，也有可能是抗体的原因，现在抗体出问题的几率也不小。

ilovelife

楼主的意思是想测内源性的GFP表达（分子克隆手段引入的GFP），不同于抗体铰链的GFP检测吧。楼主可以不用福尔马林处理，直接用DAPI染细胞，然后在荧光显微镜下和光镜下分别拍照即可。

yinjiqingqq

回复 phdyhm 的帖子
! G9 q; Y; V$ N: v9 }  b0 E, B/ |' N9 B' h
我以前做冰冻切片检测荧光时，也出现类似情况，不过我是用丙酮固定的，你可以换成乙醇试一下。如果不行，就做石蜡切片吧，用抗原修复后，效果还不错。