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[讨论] 关于组织切片中GFP的检测 [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2011-11-26 12:13 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
含有GFP标记的组织冰冻切片后,在荧光镜下可以看见有明显的发绿光荧光的细胞,通过福尔马林固定,再做免疫荧光,绿色荧光细胞就基本找不到了,请高手分析下原因,下一步应该怎么做?
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沙发
发表于 2011-11-26 15:44 |只看该作者
福尔马林主要成分是甲醛
4 }& n9 k* h+ D, O5 r. a" w) ~规定那个是会发生蛋白交联从而荧光淬灭$ W' h- g) i! S
试试抗原修复也许有效
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藤椅
发表于 2011-11-26 15:45 |只看该作者
福尔马林主要成分是甲醛2 r0 G8 _4 p7 U: K% ^6 Z
规定那个是会发生蛋白交联从而荧光淬灭7 ^( O) x5 z; ~+ l
试试抗原修复也许有效

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板凳
发表于 2011-11-26 22:51 |只看该作者
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嗯,同意楼上所说!福尔马林固定后应该是看不到GFP的自发荧光了的!你可以用免疫组化比如anti-GFP来看GFP的分布吧!
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报纸
发表于 2011-11-26 23:01 |只看该作者
福尔马林固定只是一个处理步骤,最后肯定是要使用抗体的。我说的是加了anti-GFP以后出现的情况。
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地板
发表于 2011-11-27 10:19 |只看该作者
1、蛋白可能降解。理论上蛋白在取材两小时后就有不同程度的降解了。: a4 O2 Q. o1 }) p# ~
2、其他的某些物质在操作过程中如果渗入组织中也可能产生干扰。先前有检测皮肤组织中绿色荧光,发现苦味酸也能在检测到绿色荧光。
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发表于 2011-11-27 10:23 |只看该作者
下一步,你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达,做好阳性对照,也有可能是抗体的原因,现在抗体出问题的几率也不小。
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发表于 2011-11-27 10:23 |只看该作者
下一步,你可以直接用免疫荧光检测GFP在组织中的表达,做好阳性对照,也有可能是抗体的原因,现在抗体出问题的几率也不小。

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发表于 2011-11-29 03:50 |只看该作者
楼主的意思是想测内源性的GFP表达(分子克隆手段引入的GFP),不同于抗体铰链的GFP检测吧。楼主可以不用福尔马林处理,直接用DAPI染细胞,然后在荧光显微镜下和光镜下分别拍照即可。
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发表于 2011-11-29 09:36 |只看该作者
回复 phdyhm 的帖子$ G" J' c5 Q7 X" `2 w/ `( i. _) {
9 O# U1 H' J  t1 z) u3 `
我以前做冰冻切片检测荧光时,也出现类似情况,不过我是用丙酮固定的,你可以换成乙醇试一下。如果不行,就做石蜡切片吧,用抗原修复后,效果还不错。
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