荧光燃料选择

飞翔的十字架

实验需要要对细胞进行多染，初步计划是染蓝色的核，还有FITC 和 TRITC ，但还是需要一种颜色， 请大家给点意见，没有头绪阿

maomaoma

好的资料，谢谢！

siyue13

可怜的，上次买了一个给一抗标记的试剂盒，试剂盒要求抗体浓度1mg/mL,结果买好的抗体浓度太低，标记不上。还是用二抗吧

susannajoke

有，试过，我以前做三标时候，有个Alexa Fluor 488结合好的抗体。这个是把前面两个一抗过夜，二抗分别加完冲干净后，单独加入这个Alexa Fluor 488结合好的抗体，37度2小时，就可以出结果了。效果其实一样的，就是省了步骤，价格也不便宜，相当于一抗加二抗价格了

飞翔的十字架

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: h# N  d, Y! A
4 a7 E" `  X' T9 w# G4 }7 d" S不知道你有没有试过直接带标记的一抗  这样的效果和一抗＋二抗比怎么样

susannajoke

- ]& s4 B" T# M/ L1 h
3 L) G$ p, y4 N/ V! C$ W
我做过的三标染色，二抗种属没有交叉，加入二抗同源的血清封闭，一抗是三种混合在一起4度过夜，二抗是一个一个加，分别洗干净，效果还可以。: G. W+ w+ X5 B
& n5 F) ^3 C3 W, z, K
Jackson公司给的方法是各种一抗与二抗分开加，
0 Q" X. a* w$ Y+ u" I例如：1.Donkey Serum 封闭，Goat Anti-Antigen A（一抗A），Probe 1-conjugated
! f. B. \9 }; J* cDonkey Anti-Goat IgG（二抗A）；
/ ]& D3 {& ^0 ^0 z/ D' ^+ T5 p! f' w2.Donkey Serum 封闭，Rabbit Anti-Antigen B（一抗B），Probe 2-conjugated
3 Z5 r- s% S, m/ @, N: bDonkey Anti-Rabbit IgG（二抗B）；
$ c+ G/ p0 \" v# V3.Donkey Serum 封闭，Rat Anti-Antigen C（一抗C），Probe 3-conjugated: d; ]$ W; b* X
Donkey Anti-Rat IgG（二抗C）；
/ J/ W1 p+ a; [/ R' I- \2 B请参考http://www.jacksonimmuno.com/technical/multiple.asp
! {, Q  N1 g$ x0 y% T7 ~  y/ n. s/ d这个方法比较费时，可能效果好一些。
) B4 @( e9 ^% X做多重标记的抗体要求比较高。; Y: h$ W- ^& ]6 F& t! f& M) a4 @
3 z: O% P8 k  @  S' Q
最近我可能准备做上述二种方法的对比，坐下四标，准备学外国实验室的把一抗孵育时间延长2——3天，可能效果会比较好。
3 `5 G: g% C: F0 t* q& ^9 {. w用防淬灭剂封片后在我们荧光显微镜下看看有没有阳性表达，在去别的地方用共聚焦照片

飞翔的十字架

回复 susannajoke 的帖子0 P" }0 ]; Z0 T1 w& [! ^. j& s
) n" i2 f, B  Y% i; p9 n) B0 ~
十分感谢！
; p( C& [( D5 o8 s' z4 D请问你是都是一抗＋二抗的方法吗  如果要标记三个，一抗怎么加？: M  v& }9 ~! ]' W4 w( C4 u
一起加还是一个一个加

susannajoke

9 I0 w" h6 K# v& @6 W4 P

- v6 y7 M  @0 E% h1 W+ ^% p以下是常用的免疫荧光的二抗荧光基团，前面的可由后面的Alexa Fluor或DyLight 荧光标记物所替代：( t2 s. E2 m( e1 Q2 n+ ]
AMCA, coumarin——Alexa Fluor 350；
8 e( @; |2 m0 J2 f4 z/ oCascade Blue——Alexa Fluor 405、DyLight 405 ；
! y: b- e5 y( K- b6 ECy2, FITC (fluorescein)——Alexa Fluor 488、DyLight 488；# ~& {# X, y$ _, n% y' |6 \
Cy3, TRITC (tetramethylrhodamine) ——Alexa Fluor 555、DyLight 549；( L/ ?8 y3 _+ Q4 _6 m  \
Rhodamine Red——Alexa Fluor 568；
' {* r: g: L. u8 ^1 KTexas Red——Alexa Fluor 594、DyLight 594；$ `: g/ j2 M8 z0 K
Cy5——Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, or Alexa Fluor 647、DyLight 649；1 W) A8 k$ R! |
Cy5.5——Alexa Fluor 680；* L! J$ ?9 K1 s
Cy7——Alexa Fluor 750。
' z; d9 ?% O2 c0 `& J9 f" T下图为染料激发光谱和发射光谱，希望你结合你们的荧光显微镜光源来选择合适抗体，加粗的染料是我推荐的。0 _* P  ]( }) P, q1 S1 j% X9 X+ \

- ?+ G, C% |+ v& K% L( Y+ h/ B5 d" d

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1 e' X" a# G: ?0 i; D* J) a# U
- C* B6 o4 s* x& t( V' R附两张图片* F- d4 }  e# p$ q9 f& i

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% o0 A# D9 c, Z: ~+ I, D3 e+ _4 @& q$ F6 s* ~3 L) P
其中，Alexa Fluor为Molecular Probes(Invitrogen)公司产品，DyLight 为Jackson公司产品。
" G9 W0 U( A% K4 C! uAlexa Fluor 350——亮蓝和紫外光激发；3 C. t# X5 H) z& `* r4 q
Alexa Fluor 405——近乎完美的匹配蓝色二极管激光器；
! ~$ V( H+ H) H; [Alexa Fluor 488——最好的绿色荧光基团；3 M- `9 Y% L/ B& K
Alexa Fluor 546——Cy3 和四甲基罗丹明的替代物；
9 P( ~) w. _& Z! n- Q% rAlexa Fluor 555——优于Cy3 的替代物；
& c* I2 c8 A/ ?. Q0 P! k5 A' o  CAlexa Fluor 647——优于Cy5 的替代品；
8 }# s- ?. k' R3 F, Y, }# sAlexa Fluor 700——远红光二极管激光器的最适染料；
2 X3 G6 W8 d( s5 m  J& L3 X  Q- o. ~* W- q/ j* J$ w* D
有什么问题可以交流，我正在做免疫荧光多标，我不染细胞核，但要染一个蛋白用蓝色DyLight 405 二抗标记，其余为Alexa Fluor 488、Cy3、Alexa Fluor 647。