荧光燃料选择

飞翔的十字架

实验需要要对细胞进行多染，初步计划是染蓝色的核，还有FITC 和 TRITC ，但还是需要一种颜色， 请大家给点意见，没有头绪阿

susannajoke

: L' O0 v7 x6 n; d$ n- Q, c

, H# G, r# u4 p( p# `& Z$ ]以下是常用的免疫荧光的二抗荧光基团，前面的可由后面的Alexa Fluor或DyLight 荧光标记物所替代：0 }! y+ i" q3 ~' W2 A0 c* I' c+ N" ~# [
AMCA, coumarin——Alexa Fluor 350；
' w' v% V/ O0 NCascade Blue——Alexa Fluor 405、DyLight 405 ；
& N; d: E4 O* _; |/ D0 GCy2, FITC (fluorescein)——Alexa Fluor 488、DyLight 488；# Q" Q; `3 W; j( p5 X
Cy3, TRITC (tetramethylrhodamine) ——Alexa Fluor 555、DyLight 549；
3 q, l! N8 H" C, s7 tRhodamine Red——Alexa Fluor 568；
9 G1 [  m  |' p& p( B; yTexas Red——Alexa Fluor 594、DyLight 594；
( I* |' `  n9 Z' a" m- R2 W& P: y# xCy5——Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, or Alexa Fluor 647、DyLight 649；
! I/ X) f4 ?) HCy5.5——Alexa Fluor 680；
- k( z1 N: K9 j/ E6 RCy7——Alexa Fluor 750。
# U' W& {4 f6 a; ~下图为染料激发光谱和发射光谱，希望你结合你们的荧光显微镜光源来选择合适抗体，加粗的染料是我推荐的。
# k7 j0 `, G% w- D! k& P& h! x+ S- w4 b3 ^: ~/ v

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( e3 E' v7 p8 O# h# |1 ~
: |- H, @. D6 l, d附两张图片0 w. e% n" m4 c& }  }7 I6 p

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; f1 ^. W& r' k+ p9 F/ L
) W0 h2 k- S% b1 ?5 n其中，Alexa Fluor为Molecular Probes(Invitrogen)公司产品，DyLight 为Jackson公司产品。8 X' ^7 ~+ {" D* h+ v% X  L
Alexa Fluor 350——亮蓝和紫外光激发；
) t3 \3 x! o6 l6 G! P, w! xAlexa Fluor 405——近乎完美的匹配蓝色二极管激光器；
4 i. i) m3 C0 ], ~Alexa Fluor 488——最好的绿色荧光基团；& C3 N  Z1 a6 |( J4 x: i
Alexa Fluor 546——Cy3 和四甲基罗丹明的替代物；
& x; D6 i! O9 f3 Y; N; g# [Alexa Fluor 555——优于Cy3 的替代物；
4 `) t- D2 \, tAlexa Fluor 647——优于Cy5 的替代品；
; D& L. ^/ w* c9 k- _% Z+ Q7 C- XAlexa Fluor 700——远红光二极管激光器的最适染料；
" O2 K, {/ A3 r/ ?7 J" j$ w  k# {  V% ]/ M* |2 s
有什么问题可以交流，我正在做免疫荧光多标，我不染细胞核，但要染一个蛋白用蓝色DyLight 405 二抗标记，其余为Alexa Fluor 488、Cy3、Alexa Fluor 647。

飞翔的十字架

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6 ~6 \( H# }& ?; Q
; y+ E9 C3 M7 f7 N, o十分感谢！! r/ b; t* r8 x/ t4 [( y' u" c
请问你是都是一抗＋二抗的方法吗  如果要标记三个，一抗怎么加？
* ?) t* J: ^% ~8 W) I一起加还是一个一个加

susannajoke

# P& \3 g8 c* K. E% j5 n
5 h3 c$ N( f& n& M5 R  v我做过的三标染色，二抗种属没有交叉，加入二抗同源的血清封闭，一抗是三种混合在一起4度过夜，二抗是一个一个加，分别洗干净，效果还可以。9 d2 N! s( b3 x& T3 ~
$ P) _" S- E9 R+ O! ]! a/ d
Jackson公司给的方法是各种一抗与二抗分开加，3 z& v& @6 U- N- l
例如：1.Donkey Serum 封闭，Goat Anti-Antigen A（一抗A），Probe 1-conjugated+ ]5 v  x1 u; J' l' o
Donkey Anti-Goat IgG（二抗A）；
& L6 s8 `4 J5 m+ |* G2.Donkey Serum 封闭，Rabbit Anti-Antigen B（一抗B），Probe 2-conjugated: S6 Q8 y/ C) A' d9 Z: Z
Donkey Anti-Rabbit IgG（二抗B）；3 E. N! j3 F: F: J7 F
3.Donkey Serum 封闭，Rat Anti-Antigen C（一抗C），Probe 3-conjugated# u3 R; b( O9 ]. g4 }) Z2 d
Donkey Anti-Rat IgG（二抗C）；; W* O+ G$ [+ }, Y/ {) }
请参考http://www.jacksonimmuno.com/technical/multiple.asp7 W% `8 V2 }# u, N) |
这个方法比较费时，可能效果好一些。
2 x5 ~+ v  z6 d! t" \做多重标记的抗体要求比较高。
: t+ F3 X& w( L( @/ Z9 A# L2 U6 h
% x+ w, U% ?; ]4 p最近我可能准备做上述二种方法的对比，坐下四标，准备学外国实验室的把一抗孵育时间延长2——3天，可能效果会比较好。
. Q  @, c- x) y: f5 q7 W+ i5 x; }用防淬灭剂封片后在我们荧光显微镜下看看有没有阳性表达，在去别的地方用共聚焦照片

飞翔的十字架

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' l/ }. N1 ~# [. I$ e9 P* w5 Z  [9 R
不知道你有没有试过直接带标记的一抗  这样的效果和一抗＋二抗比怎么样

susannajoke

有，试过，我以前做三标时候，有个Alexa Fluor 488结合好的抗体。这个是把前面两个一抗过夜，二抗分别加完冲干净后，单独加入这个Alexa Fluor 488结合好的抗体，37度2小时，就可以出结果了。效果其实一样的，就是省了步骤，价格也不便宜，相当于一抗加二抗价格了

siyue13

可怜的，上次买了一个给一抗标记的试剂盒，试剂盒要求抗体浓度1mg/mL,结果买好的抗体浓度太低，标记不上。还是用二抗吧

maomaoma

好的资料，谢谢！