干细胞标记及追踪（专题讨论）

namulow

$ a4 D, n( C! Y; I2 A( Z3 Y# A8 [2 k1 J- p  E1 M5 q, e* n
干细胞培养诱导后植入体内，观察成骨效果，想做个标记，因为观察周期较长，大概三个月，经查阅文献发现，可行的办法有两个：( L# z7 ~$ R9 _- q; C2 E& a
1，逆转录病毒将GFP基因导入干细胞，这种办法在导入基因时好像比较麻烦，但是检测好像比较简单。
8 n& F2 T$ d: t( b3 }. `' H! N1 M2 _: q2，将雄性干细胞植入雌性动物，追踪Y染色体，即SRY基因，但是看文献上说SRY追踪的FISH技术复杂，费用高，但是还没有看到具体的技术步骤，也不知道具体要多少费用。0 `5 O8 Q2 f: s
      在丁香园上看到一篇关于干细胞追踪的帖子，2003年一直讨论到今年，很有见地，希望在干细胞之家的同志们也讨论下这个问题，或者请版主开辟一个关于干细胞标记及追踪的专题也好。谢谢！

细胞海洋

回复 风自在流年 的帖子% Y+ R+ [$ Y7 k* P8 e

2 s0 `6 u: V4 ?2 @  N: V( G建议你发新帖提问

风自在流年

请教各位，现在我在用DiR染料标记细胞进行追踪，原理上同DiL相同，为何厂家提供说最多只能2周左右检测，另外关于染料标记在体内造成的假阳性问题，请问现在有文献解释了吗，谢谢

fengxuechunyang

学习了，谢谢！7 x3 d" V( {* g0 b) F2 o4 |

asa_ok

收了，谢谢！

细胞海洋

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7 {5 y6 D7 e. [- ^! c0 \/ K
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lichen7325

本人实验想看看微血管内皮细胞在损伤中如何参与修复的。遇到如何标记细胞的难题。想请问干细胞之家的高手如何在原位标记微血管内皮细胞，然后在不同时期通过组织切片的方法观察细胞的迁移和转化。谢谢！看到一篇用转基因鼠做实验的文章，但转基因动物费用太高，周期太长。不知有没有相对价格低一点的方法。

大笨鸟

学习啦

namulow

Y染色体sry基因原位杂交操作步骤：8 V! u4 p2 _, o. U( K5 j. h4 u" m
一、PCR合成大鼠Y染色体特异性cDNA探针
6 J- @0 h& S6 x! i# `) ~1、  把107个细胞接种到400μl TNE缓冲液中（10mmol/L Tris、Ph7.9; 10mmol/L NaCl；10mmol/L ethylenediaminetetra-acetic acid），与400μl 20% 十二烷基磺酸钠和40μl 蛋白酶K（20mg/ml）混合。悬液涡旋混匀，37℃孵育12－15h。- r, O2 H1 h6 }9 p7 `, i
2、  DNA用苯酚提取，乙醇沉淀，TE溶解（1mmol/L Tris、ph7.9; 0.1 mmol/L of ethylenediaminetetra-acetic acid）。
  P2 t# d5 s: ~+ S3 d. ]2 `+ X. Q( U3、引物序列设计如下：5' primer, 5'-AGATCTTGATTTTTAGTGTTC-3' and 3' primer, 5'-TGCAGCTCTACTCCAGTCTTG-3'。反应混合物包括1μg基因组DNA、引物各1μm、200μm三磷酸二核苷酸、1×PCR buffer，和2单位Taq聚合酶，终体积为100μl。进行30次扩增，每个循环包括94℃变性1min、50℃退火1min、72℃扩增2min。30次循环后，再在72℃附加扩增7min。PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色检测片断大小，然后纯化准备杂交。  C% i6 D+ `  I) n" Q6 K# |/ A* |' R
二、原位杂交
' P5 N4 e2 b# g( v0 x* D1、  切片去蜡，二甲苯水化，过梯度酒精，然后用蛋白酶K（100μg/ml）37℃消化15min。0 _2 ^) S& J( p
2、  前面制备好的Y染色体cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒做标记。' I! N8 f. @$ l
3、  杂交液在42℃过夜。用荧光抗体增强试剂盒（Boehringer Mannheim）可以在荧光显微镜下观察到地高辛标记的Y染色体，由异硫氰酸盐荧光素发绿色光。然后载玻片用10ng/ml亚丙基碘化物（Propidium Iodide，红色）复染，以使细胞核染色，加抗退色液和盖玻片。阴性对照不加探针或抗地高辛抗体，其它按相同操作。3 z1 J  i% ^" a8 U2 R8 f7 n! F; s" A) _

* i7 b; F. {- v+ z4 }1 L

namulow

有文献报道说：In SPIO labeled and unlabeled cells, Gene expression levels were comaparable to unlabeled controls in adipogenic and chondrogenic conditions however not in the osteogenic condition. 好像SPIO标记的话对成骨细胞会有不良影响。