干细胞标记及追踪（专题讨论）

namulow

/ T# d' G4 _) X$ w( y
; d% i) R: s9 c# {
干细胞培养诱导后植入体内，观察成骨效果，想做个标记，因为观察周期较长，大概三个月，经查阅文献发现，可行的办法有两个：
' N+ L. |2 [- z0 h3 H9 ^1，逆转录病毒将GFP基因导入干细胞，这种办法在导入基因时好像比较麻烦，但是检测好像比较简单。- f# R% a, K/ ?! u$ d! p2 c
2，将雄性干细胞植入雌性动物，追踪Y染色体，即SRY基因，但是看文献上说SRY追踪的FISH技术复杂，费用高，但是还没有看到具体的技术步骤，也不知道具体要多少费用。) R7 y. Z5 P: M9 z" C
      在丁香园上看到一篇关于干细胞追踪的帖子，2003年一直讨论到今年，很有见地，希望在干细胞之家的同志们也讨论下这个问题，或者请版主开辟一个关于干细胞标记及追踪的专题也好。谢谢！

细胞海洋

回复 风自在流年 的帖子
; _& P& A$ w/ @7 Y( ~8 G1 \2 H% w& _* V8 c0 n' ~$ b
建议你发新帖提问

风自在流年

请教各位，现在我在用DiR染料标记细胞进行追踪，原理上同DiL相同，为何厂家提供说最多只能2周左右检测，另外关于染料标记在体内造成的假阳性问题，请问现在有文献解释了吗，谢谢

fengxuechunyang

学习了，谢谢！. B  O3 a" q- |  u& |) F; B& ?6 z3 F

asa_ok

收了，谢谢！

细胞海洋

回复 lichen7325 的帖子4 J$ `) }2 _+ F! N+ f

( ?: i) q% C  m3 i建议你发新帖提问

lichen7325

本人实验想看看微血管内皮细胞在损伤中如何参与修复的。遇到如何标记细胞的难题。想请问干细胞之家的高手如何在原位标记微血管内皮细胞，然后在不同时期通过组织切片的方法观察细胞的迁移和转化。谢谢！看到一篇用转基因鼠做实验的文章，但转基因动物费用太高，周期太长。不知有没有相对价格低一点的方法。

大笨鸟

学习啦

namulow

Y染色体sry基因原位杂交操作步骤：
5 e2 S2 J0 Q9 L* M一、PCR合成大鼠Y染色体特异性cDNA探针
) w! b1 `/ [1 l" q( }/ p$ O1 F1、  把107个细胞接种到400μl TNE缓冲液中（10mmol/L Tris、Ph7.9; 10mmol/L NaCl；10mmol/L ethylenediaminetetra-acetic acid），与400μl 20% 十二烷基磺酸钠和40μl 蛋白酶K（20mg/ml）混合。悬液涡旋混匀，37℃孵育12－15h。
3 \, |& o0 G7 j" Y1 s) k2、  DNA用苯酚提取，乙醇沉淀，TE溶解（1mmol/L Tris、ph7.9; 0.1 mmol/L of ethylenediaminetetra-acetic acid）。
  ]9 {3 D! r3 u3、引物序列设计如下：5' primer, 5'-AGATCTTGATTTTTAGTGTTC-3' and 3' primer, 5'-TGCAGCTCTACTCCAGTCTTG-3'。反应混合物包括1μg基因组DNA、引物各1μm、200μm三磷酸二核苷酸、1×PCR buffer，和2单位Taq聚合酶，终体积为100μl。进行30次扩增，每个循环包括94℃变性1min、50℃退火1min、72℃扩增2min。30次循环后，再在72℃附加扩增7min。PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色检测片断大小，然后纯化准备杂交。* y4 B9 E7 }% G2 m$ ?' k! [+ m$ k/ A
二、原位杂交* ]# @# `3 d5 m) {, ~; D( Y
1、  切片去蜡，二甲苯水化，过梯度酒精，然后用蛋白酶K（100μg/ml）37℃消化15min。
/ l' ]5 H6 q& U# C% Y# s" Y2、  前面制备好的Y染色体cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒做标记。
- T& l/ w) I+ r. z* s/ ?3、  杂交液在42℃过夜。用荧光抗体增强试剂盒（Boehringer Mannheim）可以在荧光显微镜下观察到地高辛标记的Y染色体，由异硫氰酸盐荧光素发绿色光。然后载玻片用10ng/ml亚丙基碘化物（Propidium Iodide，红色）复染，以使细胞核染色，加抗退色液和盖玻片。阴性对照不加探针或抗地高辛抗体，其它按相同操作。
% g! m8 t5 _* g: @0 ^
/ C1 l  _5 O- b; A& n  t5 W

namulow

有文献报道说：In SPIO labeled and unlabeled cells, Gene expression levels were comaparable to unlabeled controls in adipogenic and chondrogenic conditions however not in the osteogenic condition. 好像SPIO标记的话对成骨细胞会有不良影响。