请帮忙分析下RNA电泳结果

jiojoo

; B: }3 k6 a: W! {
2 `/ E4 t. |+ u8 H
提取了RNA，吸光曲线显示RNA非常纯, r7 c! J- J- R& e# `' Y2 Q) m
但是电泳结果如图所示，感觉似乎降解的比较严重。
4 p5 ^/ Z% [  Z* n5 M( i( w8 x我电泳用的是普通的1%琼脂糖凝胶，不是变性电泳0 d/ b- o- G: H1 Q9 u. l) I
那些弥散状的东西是因为电泳不是非变性凝胶才产生的吗？& A& D* \9 F. ~3 Q/ [
最下面最亮的是5s还是降解的RNA碎片？
% w! `2 h2 S3 ?- A! j( A2 Y

2011-12-4 21:53 上传

下载附件 (27.92 KB)

. Q3 D0 V& K) M1 k6 T

2011-12-4 21:53 上传

下载附件 (19.87 KB)

9 _% c- i, _% I- b
28s上面还有一条带，是基因组DNA吗？) [  Y; ~4 M8 a
之前好像记得哪里说过，实时定量PCR对RNA纯度要求很高，反而对RNA完整性要求不高。3 J" h3 R2 R1 |( \3 v" B1 s
如果只用来做实时定量PCR，这种降解程度是不是不会对结果产生影响的？
' u& g% e" v. q: J* s8 q; i忘各位前辈不吝指教

susuloveq

1%琼脂糖凝胶太小了，我都用2%多的胶跑，我建议你先用来做下内参咯，内参没问题的话就没问题了，降解有很多方面的原因的  X& C4 |4 l1 N% D

susuloveq

还有你不要跑太久了，跑十几分钟看到两条带即可，跑太久RNA也会降解的，电泳槽也不太干净的

星移龙一

是降解啦，下图有一部分可以用，但上图太差啦，最前面的是降解的。( r- K. G5 [# ^
而且我要说一下：susuloveq的说法我不赞同，我们每次的凝胶浓度是0.7%，这样可以快。

zxcv12345

回复 jiojoo 的帖子, b# f$ J- j- o) O/ d" x

. J0 {8 S# T( a& m. O5 w3 `: U从图片上看：3 x9 ~, p3 @; }) s: j: S4 b
有RNA降解
+ Q6 t5 i) t3 m8 U还有明显的DNA污染

歪歪

建议消化DNA后再跑胶，RNA有些降解对你实验影响不大，但DNA污染做出的结果就不好说了。

cneagle66

下图中间三条带的RNA还可以，虽然有降解（一般28S应该更亮），但是还可以用，其他的标本，降解严重，如果对实验严格要求的话，这样的RNA最好不用。1 Z; m% {7 a6 Q+ y
DNA污染：对于一般的RT-PCR来讲，设计引物的时候，可以横跨两个外显子，避免了DNA的干扰。对于荧光定量RT-PCR，我觉得也可以这样，比如我曾经用的SYBR green，它的扩增片段长度可以在200bp左右，完全可以找出横跨外显子的引物来。至于用探针的荧光定量PCR，我没有做过，没有深究过它的原理，因为扩增片段只有几十个碱基，可能设计跨外显子的引物比较困难，但也可以一试，不知道行不行。

ilovelife

还是要跑变性胶，否则RNA的二级结构导致你没法判断哪条带是什么。

ilovelife

还是要跑变性胶，否则RNA的二级结构导致你没法判断哪条带是什么。

huangcong1988

最上面那个应该是基因组污染，最下面的应该是5S带，感觉您这个RNA提取效果不是很好，RNA降解很严重，如果正常情况下，5S不会太亮，很亮的应该是18跟28S，另外，28S应该是18S的两倍亮是比较好的，还有就是如果做定量的话，RNA降解会有影响，但是有DNA污染比RNA降解影响更大，有基因组污染会严重影响定量结果。不知道您是用试剂盒提的还是直接用TRIZOL，还有，不同品牌的试剂盒提取效果差异很大，另外，您一次提了那么多样么？一次提太多RNA降解严重是肯定的，建议提RNA一次还是少提几个样，操作时间太长，会使RNA降解的