实时定量PCR相对定量的一个问题

ielisa

各位大侠好！小弟刚开始做干细胞，要做定量PCR，目的是为了检测干细胞分化为目的细胞过程中几个MARKER基因的表达情况。每次收取细胞样品时我是尽量做到收取的每一份样品尽量均一，即细胞数目，浓度什么的尽量一致，然后就抽提RNA，反转，做定量PCR了，是相对定量，最终结果分析用的是△△CT方法。现在问题来了，我只是收取细胞尽量均一，并没有测细胞数目，只是大概目测均一了；抽提RNA后也没有测RNA浓度，因为RNA很不稳定，我也不想测；做定量PCR有内参基因，并且采用的还是△△CT分析最终结果，如果样本不均一的话，即每一份收取的样品细胞数目不等，这对最终的定量结果影响很大么？是不是会影响到最终的数据走向？

ilovelife

样品间的浓度没有必要一致, 因为各自有自己的内参. 但是要保证PCR 效率接近100%, 否则会影响分析结果. 我一般是每次平行做3个反应, 如果条件合适的话, 一般这三个反应之间的Ct值波动会小于0.5.

ilovelife

样品之间浓度没必要完全一致,  因为是和自己的内参作比较.  但是PCR扩增效率要保证接近100%, 否则影响结果分析.

jefferson

& W0 K  o4 A5 o/ j5 [( j" E
8 O4 a3 m/ g) e$ w# ?! Q0 ?! S* q/ n直接的说, 如果这么做, 即便是相对定量, 其结果完全没有意义的.
' a* c9 e( @9 N- E% E( f$ a5 l" ]; M% C
0 W! h# a8 [( Y. _% n$ \& F微量操作遍及分子细胞生物学的各个角落, 如果能凭目测对细胞进行定量评估用于相对定量的PCR分析, 简直......# U6 l! h6 a4 N" _- p

" L2 P" ]& b* c! l, D) M: @如果不对RNA进行定量, 即使进行相对定量分析, 也作了内参进行校正, 在组内差异上, 由于逆转录时RNA量不同, 很可能就导致反转录效率不同; 反转录效率不同, 进一步进行定量PCR时效率也可能不同, 就是大家说的,用△△CT法分析结果, 要求扩增效率都必须是100%, 且不说你这个能达到都是100%, 组内扩增效率相等都达不到，用这种方法分析，有什么意义呢？
8 g: U# x& j) Z/ s
# [1 b0 t$ l6 {' |起始的数据就是不均一的, 且不说组内的差异，退一步，认为组内差异能被忽略。 组间差异就不是那么容易忽略的了，定量结果需要至少三次独立重复实验结果进行统计分析，你能保证每次你目测的细胞量都和之前的实验细胞量基本相同？略有误差，包括你抽RNA时手法上的差异，导致RNA浓度不同，最终批次间的差异进行统计分析时， 本来有差异的表达很可能就会因为标准差很大而成为组间无差异，这样的结果， 不管最终的统计结果最终是有差异还是没差异，都没有任何参考价值的。完全可能是批次间的标准差不正常所导致的。& A4 F9 @# x: ~( M- C1 g

' j  X. N6 u  n& w5 U( Q欲速不达放哪里都适用，一时的便捷，导致的就是前前后后的实验全白费，结果毫无意义。经济损失不说，浪费的时间和精力，不是钱能衡量的。
" ]  ]! `8 u/ }1 |6 B, [; o+ B9 D' P
建议你严格按照Protocol做，事半功倍。这个实验其实很简单不过，论坛里有很多讨论贴。何必偷这点懒。。。。。

savid888

相对定量，只要扩增效率接近100%就可以了，没必要测浓度，当然浓度不能太离谱，否则扩增效率不可能近100%。, \% D+ \6 E3 l" T. l
另外，DNA污染没事，需要引物跨内含子，或者DNase处理就可以了。

savid888

相对定量，只要扩增效率接近100%就可以了，没必要测浓度，当然浓度不能太离谱，否则扩增效率不可能近100%。
; E! n' r3 s3 @  P另外，DNA污染没事，需要引物跨内含子，或者DNase处理就可以了。

mayansen1314

浓度不测可以原谅，但纯度是不是必须要测一下？蛋白污染还好，DNA污染肯定会对你结果造成影响的

menghy

ielisa 发表于 2011-12-5 16:07
, L1 f1 w7 O, m9 |+ dRNA很容易被RNA酶降解，所以抽提到RNA后就很快的反转成CDNA了，没有测浓度。没有MEF的。7 N7 i9 Y  H% V! `0 w4 ]
唉，其实说白了， ...

. D4 C5 `1 T6 u
如果实验室有分光光度计的话还是要测浓度，毕竟测这个浓度的时间是很快的。不会马上就产生降解的。

lz00990735

还是应该测浓度，验证每对引物的扩增效率，当目的和内参的扩增效率都是100%时才能用△△CT法。否则就又影响。

ielisa

影响不大，确定吗？