实时定量PCR相对定量的一个问题

ielisa

各位大侠好！小弟刚开始做干细胞，要做定量PCR，目的是为了检测干细胞分化为目的细胞过程中几个MARKER基因的表达情况。每次收取细胞样品时我是尽量做到收取的每一份样品尽量均一，即细胞数目，浓度什么的尽量一致，然后就抽提RNA，反转，做定量PCR了，是相对定量，最终结果分析用的是△△CT方法。现在问题来了，我只是收取细胞尽量均一，并没有测细胞数目，只是大概目测均一了；抽提RNA后也没有测RNA浓度，因为RNA很不稳定，我也不想测；做定量PCR有内参基因，并且采用的还是△△CT分析最终结果，如果样本不均一的话，即每一份收取的样品细胞数目不等，这对最终的定量结果影响很大么？是不是会影响到最终的数据走向？

ielisa

请各位大侠帮忙解答下哈！谢谢！

歪歪

因为不稳定就不测RNA浓度，没这说法吧。不过细胞数差不多的话，内参差异也不会太大的。还有个问题，想请教你一下，你收干细胞的时候有MEF吗，还是用的无MEF的ES培养？

hndxws

相对定量，而且有内参，一般不会有很大影响

ielisa

RNA很容易被RNA酶降解，所以抽提到RNA后就很快的反转成CDNA了，没有测浓度。没有MEF的。" b3 X* [: h+ Z) F5 }# B7 p8 `: a0 o
唉，其实说白了，还是嫌麻烦不想测浓度，觉得应该对结果影响不大的

ielisa

影响不大，确定吗？

lz00990735

还是应该测浓度，验证每对引物的扩增效率，当目的和内参的扩增效率都是100%时才能用△△CT法。否则就又影响。

menghy

ielisa 发表于 2011-12-5 16:07 4 C1 J' p4 b6 D7 p$ x& D, h: m
RNA很容易被RNA酶降解，所以抽提到RNA后就很快的反转成CDNA了，没有测浓度。没有MEF的。# R+ D, M# J# i8 Q% ^
唉，其实说白了， ...

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如果实验室有分光光度计的话还是要测浓度，毕竟测这个浓度的时间是很快的。不会马上就产生降解的。

mayansen1314

浓度不测可以原谅，但纯度是不是必须要测一下？蛋白污染还好，DNA污染肯定会对你结果造成影响的

savid888

相对定量，只要扩增效率接近100%就可以了，没必要测浓度，当然浓度不能太离谱，否则扩增效率不可能近100%。: y" H, ]; M  _% u( s( f
另外，DNA污染没事，需要引物跨内含子，或者DNase处理就可以了。