求助 ips核型鉴定

bb6120

最近在做ips细胞的核型鉴定。但是结果不是很好，求有经验的大哥指点一下！！6 S! n7 y  J$ k4 E$ z
实验步骤：
* V1 i0 f7 @! ^5 m1、0.1μg/ml的秋水仙素处理一个钟。, K% v' O1 d  I, r" A: p, m% N2 O1 U
2、0.075mol/L的KCl低渗20min。
$ X) X: R, J' f+ A( q3、1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）37℃水浴预固定3min。
- D4 T# I+ j" C" x5 g4、8ml 固定液2h。: m% N& ]; U0 @3 U
5、加入6ml 固定液进行第二次固定，10min。
% K$ d% j5 v* A) C% t$ u6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成10°倾斜，每片滴加悬液1滴。  {7 @( w4 L4 I  H4 P# i* a

. G2 H6 R  c. h  K目前遇到的问题有：核型分离的不是很开！有的时候找不到核型！！
  ?2 p  H6 P" M
+ a. _8 U1 s& U3 e0 {. m求有经验的大哥指点！！！离心：1200rpm，离心10min。

genedu

首先您得确定是什么类型的细胞，细胞不同，条件也就跟着不同
, b( d( a+ i4 O8 }  p

bb6120

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+ Q; K6 B! J; Q* n8 F
0 O5 O# y+ m7 _诱导性多能干细胞（iPS）

genedu

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+ p+ P5 ^) p& a5 o( W- v( T0 D, A
不好意思前两天出差，现在回复，在您的基础之上修改，只是按照自己的方法，我的做的还算不错，自我感觉
/ H9 m* O2 ?8 e) B1、0.1μg/ml的秋水仙素处理两个钟。
* A7 R( r* D6 A. t9 p( }7 n+ ]2、0.075mol/L的KCl低渗20min。后加几滴（500ul)固定液，轻轻摇匀，离心8 n& h5 D; p$ h
3、去上清，1ml 固定液（固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。）重悬，常温操作即可。, A, `/ ?5 V5 y; W/ m8 D; b
4、8ml 固定液轻轻摇匀离心。注意我没有放置一段那么长的时间，感觉没必要
3 p6 x" s7 ^  |8 w4 D9 {5、加入6ml 固定液进行第二次固定。离心后，用1ml固定液重悬
/ v2 z' M7 a% d; ^% d6、在-20℃内取出载玻片，摆于滴片架上，玻片约成45°倾斜，每片滴加悬液3滴，滴数根据细胞量而定，一般大概10的7次方三滴即可，高度大概1m。
& e* n( O8 ?* s3 K5 Q7.1：10配染料，凉干后，10min染色后用水冲背面，晾干即可，假如不G带的话8 N/ N: s5 T9 j+ ^
求有经验的大哥指点！！！
( x0 k5 q0 h/ s" A4 N$ P离心：1200rpm，离心10min。

huangcong1988

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+ e$ ~4 \" @' r! N! L5 P
! \$ s. r8 @4 Z( D染色后，用水冲背面干嘛呢？

genedu

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; d+ x8 O! g" F' ?- m5 q7 [% P( n7 u. D8 i4 q' O5 G
就是染色后，需要将染料冲去，如果是正面的话，很有可能将核型冲走，但是如果是背面的话，不仅能将剩余的染料冲洗干净，而且不会冲走核型，完全是个人经验，建议您一使

huangcong1988

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$ y$ f7 N: \4 S. X- u: K, x% z1 N' }- ~; y
: L5 V/ u7 o- P$ J, u但是冲背面怎么能把染液洗去呢？染液在正面啊

genedu

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- L# u) }/ i8 z, ?
% N$ @. v; p' D! Z3 p- {嘿嘿，您先试试看，此言不虚

huangcong1988

回复 genedu 的帖子9 `7 `9 p. {* s- e
+ V# |( q7 a$ D' ]+ ~8 @
我还是用水洗的正面，就是很轻轻的洗，因为洗背面染液根本没有反应。。。

lcxlorna

注意事项：
+ e0 l1 C6 {7 ^2 v( o+ F1、秋水仙素处时间延长到4h。
) s7 N4 q9 E' N, H6 H+ O/ V2、0.075mol/L的KCl，37度预热，低渗20min# m7 t3 G4 ]. U
3、干净的载玻片在-20℃要冷冻，滴前取出，取出后马上滴，最好拿高点儿滴，越高越好，这样细胞分散的好，且能摔开，高度20cm: {. k: C3 ]8 N7 {% |& A+ V
4、燃料现用现配，* D& D6 n/ V9 `5 \$ Y8 S# z
试试看