急 加急 火急

fwyou

我有完全互补的上下游寡核苷酸 想退火使其互补
; k# G$ s. \' j" C  e. Z( T3 h. j7 q) h0 i
具体步骤是什么？群友帮忙一下吧

cneagle66

95℃ 5 min, 然后每降低1℃保持90s, 直至降到30℃, 维持30min, 随后再降至4℃后, -20℃保存。

cneagle66

方法二
/ u3 s% ]# m  P3 B% A' V0 T$ q1.退火。退火buffer：10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA。
0 Y6 z, k# r1 c! E0 N2 L  u- j, N退火体系：两条寡核苷酸片段各2µl(1µg/µl)，1×退火buffer 46µl。
9 ?. C' f$ C5 G5 R4 O& R95℃ 5min,然后自然冷却到室温。
) S+ P% r5 S* M0 c" `  @2.载体酶切，回收（按照正常）1 J; K8 \; q4 M1 O3 s
3.连接。
- C3 @! Q) f+ |5 L9 M, C- H2 [; @& _: P+ |( ]* @, K
方法三
9 m8 H3 F. ?0 T" J, K5 n退火条件（供参考）：$ p# U  }/ c1 p/ y9 J
99℃ 2min  h3 b- D* H  _
72℃ slow down 30℃ 90min
, N5 |3 v. R0 e0 z0 q4℃保存
% m8 j6 m8 ^6 p

hndxws

楼上的可以做到，但是做实验的时候不用那么复杂。我做的时候是95度5min，然后直接自然冷却至室温就可以了，也是没问题的。我曾经这样做shRNA的克隆