western的烦恼

luoziwei

跑的western胶，转膜后分别对凝胶和膜做考马斯和丽春红染色，为啥都没条带？蛋白marker的泳道倒是很好。急求解答

king8

综合你的情况，分析可能情况如下：
% Z3 _/ G! r9 h% I- D1  提取蛋白质会不会出现问题
- _6 [$ ^" ^+ w9 Q% X- R, ]# k2  电源正负极设置是否正确
/ v, v3 e3 S  v3  转移缓冲液是否失效（尤其是电转液）
. w' a% M6 G1 b& V* o建议：! ^+ F: {  m) o& {6 L
1  提取蛋白后定下量   跑个明胶用考马斯亮蓝染一下3 l: T$ @8 o4 g
2  重新配置缓冲液      我都是用新鲜配置的  并且只限于当天重复使用! }- I# D( M' G/ A6 Q% {* s1 _
3  若是稳压转膜         观察电流情况   电转液温度
. Z, Z  j) _4 k, t) f) U; S希望对你有帮助

ppt

可能是：1样品浓度不够，2换个loading buffer，调整后再试试

zxcv12345

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/ Z, U. @3 s( _6 T3 |; k$ W. W+ j. I+ J/ |/ C
如果你跑的是SDS-PAGE胶，你的Protein marker没有问题，十有八九是你的样品没有蛋白或非常非常少。# l3 b' p! }& L* ~! |& a
重新提蛋白吧

luoziwei

回复 zxcv12345 的帖子4 M4 f# `# y6 Y6 B7 z
( v# `! l1 `% b1 m" A+ Z1 W: m
蛋白定量是1.0 ug/ul以上，上样量有接近30ug，这是我头回遇到这种情况，不晓得蛋白跑哪儿去了？转膜才转了2小时，不至于转出去了吧？

luoziwei

回复 king8 的帖子, V# X9 B: C5 r% Y

+ ?6 F7 W- Y9 Y+ n+ K& a( q1.蛋白不会有问题，样品浓度都在1ug/ul以上
7 I+ A& C3 A& {( j: r$ H0 M2.正负极错误的话就不会在膜上看见marker 蛋白了% W3 N9 l; E# ^6 s  f

luoziwei

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+ _( e/ j) \  s2 ?! M& c$ X( c, a( J$ V& m5 K1 j
对啊，我怎么没想到loading buffer呢！多谢提醒

mayansen1314

你用干转还是湿转？转膜时候膜跟胶结合的紧密不紧密？你用的是预染marker吗？如果是的话你的膜上条带是不是清晰？如果预染marker在你的膜上，那就可以排除系统问题，直接重新提蛋白就好。
5 g# l# v# P! ^) B6 \$ G. ~2 P另外，请教你提蛋白的时候的裂解液配方，有没有加特别的蛋白酶抑制剂？

dianying

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$ W" |' L+ U+ q& e! t
0 y/ F, a/ Z; X/ S* E+ g你可以加用一个“Magic Maker”，它在跑胶时就能看见有没有带了，如果没有你就不用转膜了。
# d3 o6 j# ~9 V  E+ [  J  O' L我转膜都是在4度过夜的。- N7 y/ ^/ A- a+ i
你的样品不够可能也是原因。

spchsq

luoziwei 发表于 2011-12-21 10:40
, K/ h) b0 V; Z) ~回复 ppt 的帖子4 I' o+ q0 m1 H  W6 q8 y% D2 _; n
9 w5 a3 D* S* K" u, `6 p* M* i5 V
对啊，我怎么没想到loading buffer呢！多谢提醒

/ m4 e4 z# [# G
后来呢，是不是loading buffer 的问题，试了吗