western的烦恼

luoziwei

跑的western胶，转膜后分别对凝胶和膜做考马斯和丽春红染色，为啥都没条带？蛋白marker的泳道倒是很好。急求解答

king8

综合你的情况，分析可能情况如下：5 G( M: m* o! T0 I8 G+ Z3 I
1  提取蛋白质会不会出现问题' q' |/ M6 s: s5 L! \2 T1 F
2  电源正负极设置是否正确5 |  M0 V' A: Z8 n  {
3  转移缓冲液是否失效（尤其是电转液）
6 m: f: G$ M- Z! ~- ^; ^+ m建议：# o6 z. g, g# l, T8 \7 r' V
1  提取蛋白后定下量   跑个明胶用考马斯亮蓝染一下/ b1 C' F3 F  ]) n4 u
2  重新配置缓冲液      我都是用新鲜配置的  并且只限于当天重复使用
6 I, j: p( H' p& |. L8 \4 U3  若是稳压转膜         观察电流情况   电转液温度; d  [' ~1 b2 F2 v8 ^9 o' x
希望对你有帮助

ppt

可能是：1样品浓度不够，2换个loading buffer，调整后再试试

zxcv12345

回复 luoziwei 的帖子+ j" H9 `+ w+ |; @1 f- d7 Y: Q
0 F4 B0 U5 d5 y! l
如果你跑的是SDS-PAGE胶，你的Protein marker没有问题，十有八九是你的样品没有蛋白或非常非常少。
) O4 j1 }4 X4 {6 d% y重新提蛋白吧

luoziwei

回复 zxcv12345 的帖子) c: F/ s4 d( E5 y1 q7 ]9 D/ |

# v4 N  N" ]6 w! L8 j蛋白定量是1.0 ug/ul以上，上样量有接近30ug，这是我头回遇到这种情况，不晓得蛋白跑哪儿去了？转膜才转了2小时，不至于转出去了吧？

luoziwei

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+ _4 G# s. x4 Q" M: {, }7 ~5 O- L
; y9 \: u) u) v7 {! n1.蛋白不会有问题，样品浓度都在1ug/ul以上- u0 ^9 [% S$ |$ u
2.正负极错误的话就不会在膜上看见marker 蛋白了
% S) W) `( Z- ]% x4 D

luoziwei

回复 ppt 的帖子- a+ M& S8 ?* t

  `- g- G. j: p0 N对啊，我怎么没想到loading buffer呢！多谢提醒

mayansen1314

你用干转还是湿转？转膜时候膜跟胶结合的紧密不紧密？你用的是预染marker吗？如果是的话你的膜上条带是不是清晰？如果预染marker在你的膜上，那就可以排除系统问题，直接重新提蛋白就好。
7 B# P# _! J/ |& M( i另外，请教你提蛋白的时候的裂解液配方，有没有加特别的蛋白酶抑制剂？

dianying

回复 luoziwei 的帖子0 p6 x2 E: E/ _2 ]( E! E- m' u

$ F# t* Y4 K5 c" H+ D你可以加用一个“Magic Maker”，它在跑胶时就能看见有没有带了，如果没有你就不用转膜了。
# s* f( x8 E- ^0 J- U, q$ {0 @我转膜都是在4度过夜的。
9 s* |8 b2 _& I  _& q' G. G你的样品不够可能也是原因。

spchsq

luoziwei 发表于 2011-12-21 10:40 : ^7 _( c! L1 ^1 Y9 \7 B
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/ ^3 e; B; a) |. o) [$ C, X8 ~* y; E9 W$ V9 o; x5 |8 k6 H) n
对啊，我怎么没想到loading buffer呢！多谢提醒

% J  o' S* s- ?, q后来呢，是不是loading buffer 的问题，试了吗