如何控制实验室中的支原体污染

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, P! @! f& U: {) G造成支原体高污染率的原因为： - j" E/ D* w" W/ H; s8 l2 ^* y
      1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） % i7 b  c! r) A% W) U0 K! w
      2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 # T+ }2 b( c) z! m! j2 a: w7 k
      3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 $ P1 L. B, g& S
      4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 : W0 @' {* E  e/ H+ l3 O
      5、研究或操作人员忽略污染问题' y) ]7 z* e! V! t5 ~7 ^! B; C  ~

/ J3 R9 h8 }0 a/ B支原体污染了来源：
- U+ _7 r8 M2 W/ W+ N& g$ M* c! d; D      1、已受污染的细胞
* |! @# e/ R- q: l) t- V      2、操作人员的疏失
) J6 ?8 U0 V. z. F" @      3、已受污染的培养基、血清
  ]  f4 Y* t" f* U$ B/ }2 }      4、操作环境不良、实验器具不洁等
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( D+ h9 _% ~$ F3 S+ a: V& E由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
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% F  v$ A* }# d7 x0 h6 q去除支原体污染：
. z3 ^6 M2 E# M6 p      1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
3 J' q5 G9 H# ^! f. t. Y      2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
% K, U/ K- L, T& c$ a* O6 r      3、Anti-sera
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预防与控制方面可从以下各点加强注意：, b3 e0 K6 |" A# D, H, ^

, V5 U) c: I2 p- B设备方面： 6 k5 P  F9 Q  C. h! L* ~1 U
      1、使用已作支原体测试ok之细胞株 8 e: A! s+ P6 }7 I  M) y7 `
      2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
( y9 {# l: h( ~( |      3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
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检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。8 u# u  w5 c& W" |, S

; A& F* Y3 P% _+ Q' ^实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
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, y6 i! i' J8 Y. Z4 K0 D" @有关支原体污染之问题与回答：- a7 d: K; e, B" I% s
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1、应如何避免细胞污染？" `4 A/ S3 W; r9 R0 K
      细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。  M4 L  S% f8 [$ f7 {; f
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2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？6 l- U8 @. n) b2 K8 ]2 {1 i' @
      直接灭菌后丢弃之。) P  Q9 I  z# U/ y" F  E; K

. \9 p; O7 \; @- _3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？  ^2 U. N: N3 S5 |' B" q0 b
      不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。7 T8 N1 ?$ G; ^% r0 x' s

; H& D6 A/ O& T+ K1 t4、支原体污染会对细胞培养有何影响？7 S7 D4 D3 I7 r- h- D0 `2 p. D5 N
      支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。7 d0 W" t1 }2 K2 H3 x

9 c0 w. Y5 `; i& S+ ?5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？! O5 L, M( t( P
      直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 & ?; l0 K  Q* q/ |! Z1 M
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支原体之检测： - `7 k0 a6 T4 I) P

. \3 c1 X7 R3 o* v7 m1 E6 n( r直接培养法 + H$ u& F7 l& }% n6 j& ^* S

' U2 Y) ?8 |3 H* q- e 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。) G7 o. o: M: k, U( A
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特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
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缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
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材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） 3 D& s8 r1 P: g" |' q1 H
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培养基制备：
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基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
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· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 * Z4 K# K- p4 Y  l) A$ a3 v+ \
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· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
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· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 , A6 S5 ^' i! Q, C2 i4 X, k9 @

4 \) \; @9 Y. T6 N* B& }, ~4 V+ @步骤：0 ^9 I0 O; ]1 d- ~
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· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
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· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。* T/ p2 Z# \2 f9 F5 J
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· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
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* I" [9 O' t( g2 A结果判读：
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· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
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& s8 |% Z1 ]- x: x· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
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# S# ]$ @; B1 v; [. k; \· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。+ @. P% {5 p! v7 W1 o) S

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