如何控制实验室中的支原体污染

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造成支原体高污染率的原因为：
, M8 A' @* G2 M- s. n      1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） ! t8 k  b; e% ?1 T) p7 F' a
      2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ( x- x! R% W9 \4 g3 Z  R; O
      3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 0 ]0 x5 t% d/ R$ k% k! x& q; M
      4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
) L/ P/ c7 q, r" p" P) |" ~4 w      5、研究或操作人员忽略污染问题
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支原体污染了来源：6 q% C* D- ~$ b
      1、已受污染的细胞 ' r1 M, o: W5 W* f" h
      2、操作人员的疏失
# U8 d. B( {  l  ^+ ]) q4 J5 D1 g      3、已受污染的培养基、血清 1 ?' \. J' u+ E$ Q, Z/ y
      4、操作环境不良、实验器具不洁等
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由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。( }2 E6 Q; E4 d5 P9 B5 K" p, g
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去除支原体污染： 3 z* [" e$ {4 T
      1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 4 o4 n+ d, u) I
      2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
' w5 ]" d' b7 x      3、Anti-sera $ q! j* p7 o5 F# N2 p; D4 U1 v9 |

8 g8 D& `$ F0 j预防与控制方面可从以下各点加强注意：
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. I3 C' z- p7 h5 S" Y设备方面： ! d; L6 k4 c- _- v9 N0 D2 s6 B% x& p# O
      1、使用已作支原体测试ok之细胞株
3 j( ]" S( W6 U/ N* @      2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 . W" H" j$ i1 L7 P' p0 @
      3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
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6 Z+ M7 z2 ?7 P( u! {检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。* c4 L3 d- Z; g- @" n2 ?
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实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
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有关支原体污染之问题与回答：8 E; U" @- n2 O3 J$ ?

1 W& A7 U7 F( a( o* t1 W. ~1、应如何避免细胞污染？
& U; E( ?0 a. E* j  ^; c' O      细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。1 B- ~) {' k* S! b: X: ?

( a% g  K0 H7 E5 ~! U2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？% i' z5 k0 s& h6 |# o( c
      直接灭菌后丢弃之。& M7 s+ O4 G# {( H: F7 `% C% [$ z+ ~

& u* f8 @0 s8 v2 V+ X& V" h' N3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
9 u5 j9 p1 ^) D& P) K; x; P      不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。& L8 |/ v) j3 x( `& v: C
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4、支原体污染会对细胞培养有何影响？/ r$ x% D2 p5 S1 t! \0 j
      支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。, a: ~' D2 K* G
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5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？3 `* y2 \* D" b! R6 @$ v
      直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 " S, F8 [- i  F6 W# x: i

. e" I0 {+ k: ]: j  b支原体之检测：
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直接培养法 $ F8 X2 V9 Z- u; b
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原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
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特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。) P/ s7 e( h3 ~2 z
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缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
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材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） , |; r0 O5 }, v# W1 D
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培养基制备：
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9 G4 e, `- Z0 ~( r7 Y, @  D4 f2 W  M基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。" M3 ^/ |4 a# C8 z% }
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· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
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· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
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· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
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) ~* y* i+ d$ B* [, M步骤：
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· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
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$ t% F/ A! M. R- y1 h+ k  o· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。9 S0 k' |3 m6 a( r  v  k
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· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
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0 D3 _, W$ b" [3 C& l: b结果判读： & ~! X4 z  ?) f# b

/ i" V9 Q. v1 [) T2 d5 U0 a0 C· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。4 d8 z  u+ P$ s, j) ~

2 F% M; j. q8 Y* T) u# o" J+ m% Y' k· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
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3 @( G- K! w' `· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。* @/ \8 y0 ~! e  ^
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