如何控制实验室中的支原体污染

cbjonathan

已具有检测的PCR平台
! ~- Y) `  K% P5 L* R细胞 培养基 培养箱都是新的
4 Q# _* R, ~, k, I0 w, k请问是不是不是层流实验室就做不出来IPS: P. F2 n7 U3 R8 K2 B( \
如果支原体来源于空气 那是不是防不胜防

dianying

回复 cbjonathan 的帖子8 \+ Q6 H8 Q8 p) [3 ]( p
2 S: M* `: @1 M3 M
造成支原体高污染率的原因为： , m2 f* y! N" M/ X) ~
      1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
. {( ~+ r/ P! r0 l& ^8 F      2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
" N" L6 x0 H' u! ~) p1 W      3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 1 m* S* P# ?2 }5 C
      4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 9 d6 T% D: Y& a  g* X
      5、研究或操作人员忽略污染问题
' b/ C# [0 F3 ^! @1 b* c
, r0 o( [3 C: R  C7 R- D9 `支原体污染了来源：4 n& q1 h( O, N/ @
      1、已受污染的细胞
8 B( e1 j4 H, i& r, D      2、操作人员的疏失
2 p0 _7 H. s6 m# a9 _4 F0 |      3、已受污染的培养基、血清
% Y: g6 _+ @3 @, z+ @0 }6 K      4、操作环境不良、实验器具不洁等
  }3 \: q: K/ @& @
, L6 D! V- D) h% x由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。9 w: X( h8 C# K: ^

* i4 K4 g# I2 c: M' d$ K" Z去除支原体污染： ) q# s5 h& p- g, f' u  Q/ Y; g
      1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） & C; z0 D9 i/ l0 _( h) U, z: P9 Z
      2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3 \8 a' P, S- }0 Q+ u8 k3 M+ s+ O
      3、Anti-sera
, x8 r  k. j  }. E
7 M" c& j: n1 |% `预防与控制方面可从以下各点加强注意：7 b# n/ t8 ~! S! g9 M0 x) ~
1 p# T, N8 E3 ]6 i( R6 w
设备方面：
; _+ O/ z" F+ K; u( I. q5 m      1、使用已作支原体测试ok之细胞株 2 O/ Q  }" s1 H
      2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 " l0 K$ X) N* Y- N* i3 w) _0 K
      3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 ! z2 [; [2 r7 O; G7 ~

# Y! x- @2 L3 A$ J检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。) E4 e  n$ l2 l1 g- O

4 X- @' X/ ^( X7 }  P实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求" r4 W2 d: w2 Z2 n
3 f& Y. W# K' s& r
有关支原体污染之问题与回答：
/ v: C3 ]) }9 k, Z+ ]2 a* n8 F- P. g- w
1、应如何避免细胞污染？$ w: u4 D# o0 m) r0 A. B
      细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。% O: {1 J$ P2 s/ b$ l% B
/ Q; ]' P: j  m6 y) I* Q
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
) o# D8 b& V7 v! r7 V  f      直接灭菌后丢弃之。- @; `, x1 s% e: C, t- P

2 Z  B" @* z5 e3 T& U; q3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？! g3 u7 j2 M. g0 U  Q$ p- S
      不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
2 h" p6 s4 t5 p- l# b& d- G
, }% C. E8 |3 e; M& M9 l% ?4、支原体污染会对细胞培养有何影响？: t6 |9 L3 T9 d( I% O7 z+ i4 Q( S0 G
      支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
5 _4 [! A! d4 v( E
+ ?( z* E6 M$ S/ `/ l+ m5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？1 K5 l# R( z9 |
      直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 ! f: }: U& W9 d+ v  i; n
- N$ ^" Y4 G9 r* r8 ~4 w
支原体之检测： * T$ Z5 E& `/ F2 M

7 S5 i3 c4 b  H9 j% E+ S: p2 d* |6 Y8 y( w直接培养法
" [0 z8 e# f% n8 Z( @$ D1 F
1 M0 R' }* z2 g6 U$ F 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。. ?5 G( z$ }4 `/ B9 |) o+ `
0 i3 X* U9 B, r
特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
. a! }. r: c# N* U+ w
, r+ q* p8 ], ?; [4 }4 K9 {8 i缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
2 Y0 a3 _( @, X1 l+ V& S
9 ^+ ^6 r$ v8 W1 V) h& c  R材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） 3 E1 e( p% p# [% g: w
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培养基制备：
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5 [* S/ ~. |: W! X& A# N基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
& }7 b2 m. b/ F$ U/ S$ ~( X- j2 v& _
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 6 x2 i) c' u7 c% X
9 T% l7 N( q& m/ ?! ^6 u2 I
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 - |7 Z% |) J1 J, M# Q
8 Y  r/ x3 L$ t$ C& Y2 a4 o. L
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 # ?- M9 @" i3 a: b6 d$ w  \
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步骤：2 i! k: F& u5 p# q' O4 Y/ O
8 C  d! z0 y$ ?% r) G3 `
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。1 [# |9 Z. S  k/ p& I5 k

0 t: ]+ s, R1 k· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
7 e2 a4 d) ]* q4 x) m( {2 F
- d  D; f; @7 t" H3 g· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
: n0 i; D# Q( _& t2 ~; w' T7 B/ }4 }6 g4 b# x
结果判读：
. J9 D; z6 ^2 {- z: `2 N! c; V: B2 |3 K# W8 ?# w9 V8 U
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。4 N/ }- P! z. o# X  {" \* C% h  N
, p" `. S0 }( m( |  i3 O
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。( H) b* M* ]2 u
  \0 T+ f: x- \  G; r5 p2 |+ u% S/ L
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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, m/ O5 @+ G4 v6 s+ s

cbjonathan

还是想问
5 E) }1 a0 W3 K) i# x不是层流实验室 普通的实验室可不可以做出IPS

艾心痕

只要你的超净台或安全柜没问题，操作小心，注意消毒，一般是能克服污染问题的。

bigsnow55

现在处理支原体相对简单了。可以使用InvivoGen公司的Plasmocin试剂（ant-mpp），无论是用来预防支原体污染，还是处理已经有的污染，效果都不错！:)

cbjonathan

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( I0 ^+ ^$ X$ w  g2 E* l: P  x* ?( S# p: Z) Q! c
那么请问
: z2 u/ a4 R# h$ O您所说的超净台没问题具体是什么意思？8 }! A0 z# z: r
长时间的紫外消毒可不可以杀灭支原体？
) ]' ]& l& u( F  ]8 T谢谢您

eley

彻底克服支原体污染是比较困难的，基本的实验要求还是应该的，比如说，换衣服，风淋等等。8 B; p. m6 o+ q! [
如果实在是没有办法克服，还可以在培养基中添加杀支原体的试剂，我们实验室就是直接把试剂加到血清里面分装，效果还是不错的，希望对你有帮助~~:)2 ]3 W, H5 A: i* q, P+ y
新年快乐~~又要上班了。。。

bsjy210

1，严格按照分区管理的方式，管理各个实验室功能间，试剂准备，标本制备，扩增，和分析4个区严格区分，工作服严谨混用。
& e4 M& _5 m! ?; `' C2，检查4个分区实验室的实验状态下的压差，压差梯度从大到小是，试剂准备，标本制备，扩增，和分析。物品流向遵循单一流向，跟压差梯度一致。
% b/ e  f  G- S) w0 |7 m3 M3，把扩增和制胶，放在生物安全柜里做，
4 h; w9 b% T. x8 P, P2 b9 b4，超净工作台只能在标本制备里设置。其余应防止外排生物安全柜。因为超净台虽然下面是层流，但是他是正压，把空气压入超净台外，就有可能把你的实验物品造成的气溶胶扩散到实验室内，造成污染你的下一个实验。生物安全柜是负压，光进风，就是造成气溶胶，也会排往室外。
, y7 c- a* `! r4 j+ R! p. D) {6 }: B  r9 q
实验室运行建设，如有疑问，可以给我留言。

song58

培养基试剂最好用新鲜现配的，还可以尝试用0.1的滤器滤一下

shashou_com

支原体污染对细胞的影响在前期是很难发现的，一般的显微镜根本观察不出来。7 G3 t. V  F/ a- X
但支原体对细胞的状态和扩增是有影响的，很有经验的话是可以看出来的。- C" i* h6 ~$ H* [& b8 q0 X
没有经验的话，一旦发现支原体污染都是晚期啦，所以要注意预防支原体的污染。6 q+ g6 C. x1 L$ F